曲安奈德抑制BN大鼠脉络膜新生血管生长

　　作者：高小燕1,何守志2　　作者单位：全军“十五”科研基金资助项目(No.02M014) 1(100144)中国北京市，北方工业大学医院眼科; 2(100853)中国北京市，中国人民解放军总医院眼科

　　【摘要】目的：观察光凝后即刻玻璃体腔内注射曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)对BN大鼠脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)生长的抑制作用机制。方法：健康BN大鼠36只随机分为两组，随机抽取一眼作为实验眼。建立BN大鼠CNV动物模型。光凝后的即刻行玻璃体腔内注射TA 8μL(320μg)，对照组则在光凝眼行玻璃体腔内注射BSS 8μL。分别在光凝后1，2，4wk各处死动物6只，摘除眼球，制作石蜡切片，利用光镜观察不同时间点的CNV的变化。利用免疫组化的方法对NFκB，MCP1和FⅧRAg蛋白的表达进行半定量检测，并用原位杂交法检测VEGF的基因表达，并行半定量检测。结果：实验1，2，4wk，与对照组相比NFκB，MCP1和FⅧRAg蛋白表达及VEGF的基因表达明显降低(P<0.05)。结论：TA能够降低NFκB，MCP1等的表达和VEGF的转录，故TA是治疗CNV的一种有效的药物。

　　【关键词】 曲安奈德;脉络膜新生血管;核因子κB;单核细胞趋化蛋白1;血管内皮生长因子;Ⅷ因子相关抗原;积分光密度

　　Triamcinolone acetonide suppress CNV growing of BN rat

　　XiaoYan Gao1, ShouZhi He2

　　1Department of Ophthalmology, North Industry University Hospital, Beijing 100144, China;2Department of Ophthalmology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

　　AbstractAIM: To observe the inhibition of krypton induced choroidal neovascularization (CNV) of brown norway (BN) rat by intravitreal triamcinolone acetonide(TA) injection after photocoagulation, and to study the mechanism of inhibition of CNV growth.METHODS: Thirtysix healthy BN rats were divided randomly to two groups, one eye was chosen randomly as experimental eye. After establishing BN rat CNV model, 8μL(320μg) TA was injected in vitreous immediately after photocoagulation in treatment group, the same volume isotonic balanced salt solution (BSS) was injected in vitreous in the contrast group. Eyes of 6 BN rats were enucleated for histological slices in 1 week, 2,4 weeks. The protein expression of nuclear factorkappa B (NFκB), monocyte chemoattractant protein1(MCP1), factorⅧrelated antigen(FⅧRAg)was examined by immunohistochemical method, and the transcription of vascular endothelial growth factor mRNA(VEGFmRNA) was Examined by in situ hybridization, meanwhile semiquantitative analysis was conducted.RESULTS: In treatment group, the positive stain optical density of NFκB, MCP1, FⅧRAg, and VEGFmRNA was obviously lower the contemporaneous control group(P<0.05).CONCLUSION: TA can lower the expression of VEGF mRNA transcription and the protein expression of NFκB, MCP1 and FⅧRAg, so it can effectively inhibit the development of BN rat CNV, which indicats that TA is an effective drug to treat CNV.

　　KEYWORDS：triamcinolone acetonide; choroidal neovascularization; nuclear factorkappa B; monocyte chemoattractant protein1; vascular endothelial growth factor; factor Ⅷrelated antigen; integrated optical density

　　0引言

　　人们对湿性ARMD所致的CNV的治疗方法做了大量临床和实验研究,目前尚无确切疗法，主要有激光光凝、玻璃体手术切除CNV和放射治疗。这些方法不可避免地有损伤健康组织的潜在危险。药物治疗方法如皮质类固醇[1]、抗血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶抑制剂、脱氧氟尿嘧啶核苷和烟曲霉素类似物等正逐渐引起人们关注，其疗效有待进一步临床观察。我们仅采用光凝后即刻BN大鼠玻璃体腔内注射曲安奈德(TA)的方法来探讨该药对激光光凝诱导的CNV的发生发展的抑制作用及机制。

　　1材料和方法

　　1.1材料 氪激光机(美国Coherent公司，型号Novua 2000);Topcon OMS300型眼科手术显微镜;微量进样器(25μL)(上海安亭微量进样器厂);ImageProPlus 5.1图像分析系统(美国Media cybernetics公司)。TA注射液(1mL:40mg)(昆明积大制药有限公司);兔抗人FⅧRAgmAb(北京中杉金桥生物技术有限公司);兔抗大鼠MCP1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);小鼠抗大鼠的NFκBmAb 0.1mL(北京中杉金桥生物技术有限公司);即用型SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);SP9002免疫组化染色试剂盒;VEGF原位杂交检测试剂盒。

　　1.2方法 健康雄性BN大鼠36只，体质量200～220g，随机分为两组，实验组和对照组。复方托品酰胺滴眼液双眼散瞳，左下ip 100g/L水合氯醛溶液3.0mL/kg麻醉，检查双眼前节和眼底均正常。随机选取1眼作实验眼，滴10g/L甲基纤维素后，依照赵世红等[2]的方法建立CNV动物模型，另1眼不光凝为正常眼。全身麻醉状态下，丁卡因滴眼液表面麻醉后，手术显微镜下，30G针头颞侧角膜缘后0.5mm作一穿刺口，微量注射器从穿刺口进针，大约为1.5mm深，针尖朝向视神经方向，玻璃体中可见针尖，缓缓注入TA 8μL(320μg)，由散大的瞳孔可观察到玻璃体中TA的白色混悬液体，轻轻拔针后，显微镊子轻夹穿刺口片刻，以利穿刺口闭合。对照组BN大鼠玻璃体内注射同样容量的等渗的BSS液。因注射造成晶状体损伤的眼均被排除实验。光凝后在 1，2，4wk观察各实验指标，每组大鼠6只。深度麻醉下摘除眼球，DEPC处理过的蒸馏水冲洗，置于40g/L PFA0.1mol/L PBSDEPC液中固定2h。按病理组织学方法梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋，蜡块4℃保存备用。眼球组织5μm厚度连续切片，置于50℃ DEPC处理过的蒸馏水中展片，捞片，置烤箱37℃烤片12h后，4℃保存，备用做HE染色、免疫组化及原位杂交检测。

　　1.2.1 MCP1，NFκB及FⅧRAg表达的检测 石蜡切片，常规脱蜡至水;30mL/L H2O2室温孵育10min，阻断内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min;切片置于盛有0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液的抗原修复盒中，微波中火加热15min进行抗原微波炉热修复，自然冷却30min;滴加50g/L BSA封闭液，室温20min。滴加一抗兔抗大鼠MCP1多克隆抗体(1∶70)，4℃过夜;滴加生物素化山羊抗兔IgG(二抗)，37°C孵育20min;滴加SABC，37°C孵育20min;滴加AEC，室温显色，镜下控制反应时间(3～10min)，蒸馏水充分洗涤;苏木素轻度衬染10s，自来水充分水洗，水溶性封片剂封片。另组织切片脱蜡至水，滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育15min;滴加一抗小鼠抗大鼠的NFκBmAb(1∶70)，4℃过夜;滴加生物素化二抗-生物素标记山羊抗小鼠IgG，室温孵育15min;滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃孵育40min;余同MCP1。另抗原修复采用滴加1g/L胰酶消化液，室温10min;滴加50g/L BSA封闭液，室温20min;滴加一抗兔抗人FⅧRAgmAb(1∶100)，4℃过夜;余同MCP1。用0.01mol/L PBS取代一抗孵育，作为阴性对照，试剂盒中已知阳性切片作为阳性对照。切片内被染成红色的点、团簇为阳性反应物。

　　1.2.2 VEGF表达的检测 石蜡切片常规脱蜡至DEPCH2O;30mL/L H2O2室温10min，灭活内源性酶;切片上滴加30g/L胃蛋白酶室温消化10min，暴露mRNA片段;滴加预杂交液20μL，于含200mL/L甘油20mL的杂交湿盒中40℃预杂交3h;滴加含VEGF寡核苷酸标记探针的杂交液20μL，原位杂交专用盖玻片盖在玻片上，置湿盒中于42℃杂交18h;滴加封闭液，37℃ 30min;滴加生物素化鼠表1 FⅧRAg，VEGFmRNA表达的变化(±s,n=6)表2 NFκB和MCP1的变化(±s,n=6)

　　抗地高辛，37℃孵育1h;滴加SABC，37℃孵育30min;生物素化过氧化物酶37℃孵育20min;AEC室温显色，镜下控制反应时间;苏木素复染20s，充分水洗，GVA水溶性封片剂封片。呈团簇、点状的红色着色为阳性。用不含探针的杂交液进行杂交作为阴性对照，试剂盒中已知阳性切片作为阳性对照。应用ImagePro Plus 5.1图像分析系统(美国Media cybernetics公司)对NFκB，MCP1和FⅧRAg的阳性着色光密度、VEGFmRNA阳性着色光密度进行半定量分析。每例标本400倍光镜下，选取连续切片中含有最大CNV直径的切片，对细胞因子的蛋白及基因表达阳性着色光密度进行IOD测量，取平均IOD值作为1例标本的观察值，每个观察时间点，均为6个实验动物。

　　统计学分析：所得数据均用±s表示。应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理，分析组内差异的显著性用单因素方差分析，两两比较用SNK检验，同一时间内的组间比较用Student t检验。

　　2结果

　　2.1 FⅧRAg和VEGFmRNA表达的变化 用药组FⅧRAg蛋白表达随时间呈逐渐增加的趋势，早期为微量的点状的FⅧRAg的蛋白表达，1wk与2wk之间无统计学差异，在4wk时表达略增加，与2wk时相比具有统计学差异(P<0.05);同一时间内两组之间相比具有显著的统计学差异(P<0.05)，可见在对照组的CNV组织中的FⅧRAg大量表达，并且随CNV生长其表达大大增加，逐渐围成管腔状。VEGFmRNA的表达在用药组的CNV中较低，在1，2wk时有微弱的点状阳性着色，在4wk时增加，且与2wk相比有显著的统计学差异(P<0.05)，但均显著地低于同时期对照组的VEGFmRNA的表达(P<0.05)。

　　2.2 NFκB和MCP1表达的变化 用药组NFκB的表达随时间呈逐渐增加的趋势，CNV形成不明显，但在4wk时间内NFκB的表达组内无明显差异;对照组中NFκB的表达呈增加的趋势(P<0.05)，同时期内两组之间相比具有显著的统计学差异(P<0.05)。MCP1的免疫组化检查显示：在4wk时间内，用药组的MCP1蛋白表达随CNV的生长而逐渐增强(P<0.05)，但与同时期的对照组相比具有显著的统计学差异(P<0.05)，用药组蛋白表达远远低于对照组。

　　3讨论

　　CNV可导致不可逆性的中心视力损害，是许多脉络膜视网膜疾病的最终结局。治疗CNV的关键在于阻断其发展过程，药物治疗是最有希望阻断病变发展进程的方法，早期使用抗血管生成药物来控制CNV的发生、发展逐渐受到重视，如皮质类固醇[1]就是其中之一。近期，人们开始关注采用TA玻璃体腔注射治疗眼内新生血管形成。已有学者通过各种临床或实验研究发现TA可抑制视网膜脉络膜新生血管形成[13]，但其机制还未知。FⅧRAg是已经公认的血管内皮细胞标记物。我们采用病理组织切片检测FⅧRAg表达，观察TA对CNV的治疗作用。1，2wk时，FⅧRAg在用药组表达无明显差异，4wk略增加，但均较同时期对照组明显降低，证实了光凝后即刻玻璃体腔内注射TA 8μL显著地抑制新生血管形成和发展。Ciulla等[1]在BN大鼠CNV动物模型中，激光光凝后即刻玻璃体腔内注射TA 20μL后，在激光斑中未见到明显的纤维血管膜形成，且在激光斑处巨噬细胞浸润减少，认为TA通过抑制白细胞和巨噬细胞释放血管形成因子而发挥抑制CNV的作用。最近，有临床资料证实玻璃体腔内注射25mg的TA可以抑制ARMD患者的新生血管[4]。TA治疗CNV的机制还未知，我们通过免疫组化及原位杂交的方法检查，可见在CNV生长的4wk时间内，在对照组中，MCP1表达随CNV的生长呈增加的趋势;NFκB的表达也随CNV生长而增强;VEGF mRNA的转录也逐渐增强。上述细胞因子可能通过多种不同的机制参与了CNV的生长发展，而NFκB作为转录调控细胞因子，通过上调其它细胞因子的表达，起始和促进了CNV的生长。其中，VEGF是促进CNV形成的一个主要细胞因子，MCP1作为最有效的巨噬细胞趋化因子，促进了巨噬细胞浸润到脉络膜组织中而促使CNV形成。在本实验中，我们观察TA对于这些细胞因子转录和表达的影响。已知MCP1基因和VEGF的基因[5]的启动子区含有NFκB的结合位点或识别位点，而糖皮质激素是NFκB的药物抑制剂[6]。本实验研究中，我们采用激光光凝后即刻在BN大鼠玻璃体腔内注射TA，发现在激光斑处CNV组织中的NFκB的表达较同时期对照组相比大大降低。有学者研究发现地塞米松可以选择性的抑制NFκBP65亚单位，通过抑制NFκB而发挥抗炎作用。这与本实验研究结果一致，TA可以降低BN大鼠激光斑损伤区中的NFκB活性，由此引起MCP1表达及VEGFmRNA转录下调，抑制了激光斑损伤处的炎症反应，达到治疗效果。MCP1表达的降低还减少了巨噬细胞在CNV组织中的浸润，降低了RPE细胞的移行增殖，也抑制了CNV的形成和生长。Kato等[7]进行体外研究，在暴露于氧化应激环境中的RPE细胞中加入不同浓度的TA，研究TA对VEGF及结缔组织生长因子表达的影响，发现可以降低VEGF和结缔组织生长因子的表达，并且与TA的浓度存在依赖关系。我们采用的是在激光光凝后即刻玻璃体内注射曲安奈德，光凝后RPE细胞及脉络膜血管内皮细胞等被激活，故TA可以对已经活化了的细胞发挥有效的作用。本研究表明，光凝后即刻玻璃体腔内注射TA大大降低了CNV的形成，抑制NFκB活化，下调靶基因VEGF mRNA、降低MCP1等表达，或直接地作用于活化的血管内皮细胞、巨噬细胞、RPE细胞等抑制血管形成因子的分泌，从而抑制了CNV的形成发展。此外，有临床资料表明TA治疗CNV除抑制新生血管的生长，还能够改善视力，为这种疗法的可行性提供了科学根据。尽管TA玻璃体内注射在某些方面还存在一些争议，其生物学效应仍需进行更为深入的研究，目前国际上缺乏大样本、多中心、双盲、随机对照研究，而且有一些还处于动物实验阶段，但是对于许多难治性的眼底疾病，如黄斑下CNV，复发性CNV，已显示出一定的优越性[8]。我们发现，在BN大鼠CNV模型中激光光凝后即刻玻璃体腔内注射TA，可抑制NFκB及其靶基因VEGF，MCP1的表达，抑制CNV生长，TA是阻断CNV病程发展的理想药物。

　　【参考文献】

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　　2赵世红，何守志.氪激光诱导的大鼠脉络膜新生血管模型研究.中华眼科杂志 2003;39(5)：298302

　　3 Criswell MH, Hu WZ, Steffens TJ, et al. Comparing pegaptanib and triamcinolone efficacy in the rat choroidal neovascularization model. ArchOphthalmol 2008;126(7):946952

　　4 Jonas JB, Kreissig I, Hugger P, et al. Intravitreal triamcinolone acetonide for exudative age related macular degeneration. Br J Ophthalmol 2003; 87(4):462468

　　5 Bancroft CC, Chen Z, Dong G, et al. Coexpression of proangiogenic factors IL8 and VEGF by human head and neck squamous cell carcinoma involves coactivation by MEKMAPK and IKKNFkappaB signal pathways. Clin Cancer Res 2001;7(2):435442

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　　7 Kato A, Kimura H, Okabe K, et al. Suppression of laserinduced choroidal neovascularization by posterior subtenon administration of triamcinolone acetonide. Retina 2005;25(4):503509

　　8 Ranson NT, Danis RP, Ciulla TA, et al. Intravitreal triamcinolone in subfoveal recurrence of choroidal neovascularisation after laser treatment in macular degeneration. Br J Ophthalmol 2002;86(5):527529