血管内皮生长因子及其受体各亚型在心肌梗死大鼠体内的差异性表达

　　心肌梗死(myocardialinfarction,MI)是由冠状动脉粥样硬化冠状动脉的栓塞，使一部分心肌缺少血液而坏死的疾病。心肌细胞的修复反应将会在相应位点发生，以保证心脏结构的完整性和心脏功能的恢复。血管生成、炎症和成纤维反应是心肌修复的关键反应。最近的研究证实新生成的血管首先生成在交界区(发生梗死和未发生梗死的心肌层之间)，然后由此向，自肌梗死的区域延伸。已有研究发现有许多细胞因子参与调节血管生成，包括转化生长因子、成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子等〔3<+1:血管内皮生长因子(VEGF)家族在血管再生和淋巴管再生中起到关键作用，在胚胎发育中能够促进新血管生成，而在创后的心脏中能够通过诱生侧枝血管来缓解血管阻塞x.5-6。VEGF家族主要有5种亚型:VEGF-A,B,C,D和胎盘生长因子。VEGF主要是通过细胞表面的酪氨酸激酶受体产生作用，VEGF的受体主要有3种:VEGFR-i(Flt-1),VEGFR-2(IkDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)二其中VEGF-A主要与VEGFR-1和VEGFR-2结合;VEGF-B与VEGFR-1结合;VEGF-C和VEGF-D主要与VEGFR-2和VEGFR-3结合。VEGF家族的各个亚型在心肌梗死中的血管再生过程中所起的作用并不清楚，笔者在2011年10月至2012年4月在中国科学院上海实验动物中心探究VEGF家族各亚型及其受体在发生梗死的心脏中的表达情况，同时确定VEGF在心肌修复和重构过程中所起的作用。　　1材料与方法　　1.1动物模型96只8周龄雄性SDSPF清洁级大鼠进人实验，其体重为(25士15)g。将所有大鼠编号为1一96号，利用EXCEL随机函数=RA1D，生成编号对应的随机数，再将随机数按升序排列，前48只作为实验组，后48只作为对照组，饲养1周后按下述方法构建MI动物模型。实验动物由中国科学院上海实验动物中心提供，实验操作在中国科学院上海实验动物中心进行。其动物生产许可证号:SCXK(沪)20110004，使用许可证号:SYXK(沪)20110011。清洁级饲养，室温20一25℃，相对湿度40%-70%，每日12小时光照维持，昼夜循环，自由进水进食。SD大鼠用1.5%的异氟烷麻醉，人工呼吸手术左侧开胸，使用丝线结扎冠状动脉左前降支，然后缝合胸腔。假手术组作为对照组(CTL组)。分别在建模的第1,3,7,14,28和42天将心梗大鼠处死(每一时间段组8只大鼠)，取出心脏保存在一80℃备用。　　1.2WesternBlot使用免疫蛋白印迹法测定　　VEGF-A,B,C,D和VEGFR-1,2,3的蛋白表达水平。取心脏冰冻组织(2mmxlmmxlmm)、裂解液(50mmol/LTris，150mmol/LNaCI，1%TritonX100,100郭mlPMSF)、玻璃匀浆器制备匀浆。在匀浆液中加等体积的2倍样品缓冲液(0.125mol/LTris,4%SDS,2%(3-琉基乙醇,20%甘油，0.2%嗅酚蓝，pH6.8)。样品煮沸3min,10000gx10min离心(40C)，取上清。用紫外分光光度计测量蛋白浓度，确定含50},g总蛋白的上样量。过程按照美国Bio-Bac公司的操作手册进行。电转后的PVDF膜室温封闭后加特异性一抗与HRP标记二抗，混合化学发光试剂两组份底物(1:2)混合，ProteinDetectorLumiGLCWesternBlottingKit加至膜上1min，最后胶片曝光显影(10min)}PVDF膜经洗脱液(62.5mmol/LTris,20%SDS,100mmol/L日一琉基乙醇)。GAPDH单抗(1:5000)电泳做内参照。结果扫描人电脑并经图像分析软件处理，得出相对光密度值。　　1.3统计学处理RT-PCR和Western的数据都使用方差分析，数据采用x士￡表达形式，p<0.O5为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1心脏内VEGF-A,B,C,D的蛋白表达水平根据-esternBlot结果显示，对照组内VEGF-A,B,C,D都有一定程度的表达。在M工大鼠心脏内，VEGF-A,B的蛋白水平一直处于下降状态，而VEGF-C和VEGF-D在第1天出现降低，在第3天后再升高，并且一直维持在增强状态(图1)。在42d的观察期内，VEGF-A164(18kDa)、VEGF-A188(22kDa)和VEGF-B的蛋白水平全部下降。VEGF-C和VEGF-D的表达在心肌梗死发生后先是受到抑制，在第3一42天出现显著升高。　　2.2心内VEGFR-1,2,3蛋白表达水平VEGFR-1的蛋白水平在1一42d内都是处于下降状态;VEG-FR-2的表达明显被抑制，但在心梗的后期阶段逐渐回复到正常水平;VEGFR-3第1天下降，第3天的时候才开始回升，到第7天达到峰值，随后开始下降，但心肌梗死组的VEGFR-3一直高于对照组(图2)。和对照组相比，VEGFR-1和VEGFR-2保持不变或者下降，而VEGFR-3在第1天显著下降后急速上升，并且在观察期内一直保持在高水平。　　3讨论　　本实验中笔者研究了VEGF家族各个亚型及其受体在发生梗死的大鼠心脏内的表达，并且探索了VEGF在心肌细胞修复和重构过程中所起的调控作用。结果显示，在正常大鼠的心脏血管内，VEGF家族各个亚型及其受体都有正常表达，表明VEGF是参与维持正常血管的生长和功能的生长因子。在和对照组比较可以看出，VEGF各亚型及其受体在梗死的心脏内存在差异性表达。VEGF-A是迄今为止研究最广泛的亚型，在大鼠体内VEGF-A包含3个亚单位(VEGF120,VEGF164和VEGF188，是由于mRNA的选择性剪切而产生，本实验结果证明，在发生梗死的心内，VEGF-A164(18kDaj和VEGFI88(22kDa)的表达显著下降。　　VEGF-A的调节作用是通过激活VEGFR-1和VEGFR-2来实现的，VEGFR-2儿乎能参与调节大部分的细胞应答反应。VEGFR-1的功能目前没有定论，但普遍认为它能调节VEGFR-2的信号传导C本实验显示在梗死的大鼠心脏内VEGFR-1和VEG-FR-2保持不变或是下降，说明}EGF-A可能是启动心内血管生成反应的关键因子，但它可能不是血管生成过程的必需因子VEGF-在病理条件下的作用的研究主要集中在肿瘤方面VEGF-能够激活血管内皮细胞生长，被认为是促进肿瘤组织增殖和扩散的首要因子，但VEGF-B在病理条件下的作用主要局限于维持新生血管生长。尽管目前对于VEGF的差异性表达的作用尚不了解，但已经证实VEGF-B和VEGF-C的降低有利于血管的再生反应。VEGF-C是通过激活VEGFR-2和VEGFR-3而产生作用，本实验发现VEGF-C的蛋白表达显著增加，与此相对应的VEGFR-3表达量也上升，证明VEGF-C是参与心梗后血管再生过程的生长因子。　　也有报道VEGF-D具有激活淋巴管再生和血管生成的作用，VEGF-D通常由多个组织器官分泌，包括心脏、肺、骨骼肌和小肠〔9」。本实验发现心梗大鼠的心内VEGF-D的mRNA水平和蛋白水平都出现显著增加，这点和VEGFR-3表达增强相一致。证明了VEGF-D参与了心梗大鼠的血管再生过程。　　总之，本研究证实了VEGF-A在大鼠心梗早期表达显著增加，说明VEGF-}可能是启动血管再生反应的关键调节因子。VEGF-C,VEGF-D和VEG-FR-3的表达都出现上调，其中VEGFR-3主要表达在血管中，说明VEGF-D也是参与血管再生的重要因子，而VEGF-B的表达降低，说明VEGF-B并不是心肌修复和重构的关键因子。但对于VEGF-C,D在心肌修复中的特异性作用仍需要进一步的研究。　　参考文献　　Zhao T,Zhao W,Chen Y. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-A:roleon cardiac angiogenesis following myocardial infarction[J].Microvascular Research,2010,(02):188-194.　　Zhao W,Zhao T,Chen Y. Reactive oxygen species promote angiogenesis inthe infarcted rat heart[J].International Journal of Experimental Pathology,2009,(06):621-629.　　Nah DY,Rhee MY. The inflammatory response and cardiac repair after myocardialinfarction[J].Korean Circ J,2009,(01):393-398.　　Zhao T,Zhao W,Chen Y. Acidic and basic flbroblast growth factors involvedin cardiac angiogenesis following infarction[J].International Journal of Cardiology,2011,(03):307-313.　　Yamazaki Y,Morita T. Molecular and functional diversity of vascular endothelialgrowth factors[J].Molecular Diversity,2006.515-527.　　Holmes K,Roberts OL,Thomas AM,Cross MJ. Vascular endothelial growth factorreceptor-2:structure,function,intracellular signalling and therapeutic inhibition[J].Cellular Signalling,2007,(10):2003-2012.doi:10.1016/j.cellsig.2007.05.013.　　Connolly DT,Heuvelman DM,Nelson R. Tumor vascular permeability factorstimulates endothelial cell growth and angiogenesis[J].Journal of Clinical Investigation,1989,(05):1470-1478.