高糖、胰岛素诱导胰岛素抵抗大鼠心肌细胞模型的建立

　　胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)是2型糖尿病、肥胖、高血压等多种疾病的共同病理生理学基础，其代表性特征是高胰岛素血症、高血糖症和内环境紊乱。建立相应的模型系统有利于在细胞及分子水平深人研究IR的发生机制。目前，较为成熟的胰岛素抵抗体外细胞模型主要有地塞米松诱导模型、游离脂肪酸诱导模型、肿瘤坏死因子诱导模型等，但均局限在脂肪细胞、肝细胞、骨骼肌细胞。笔者于2011年7月至2012年7月在河北医科大学第四医院实验动物中心应用高葡萄糖、高胰岛素、高葡萄糖加高胰岛素法诱导建立胰岛素抵抗大鼠心肌细胞模型，为进一步研究心肌细胞胰岛素抵抗奠定基础。　　1材料与方法　　1.1实验动物2一3d的Sprague-Dawley(SD)清洁级大鼠犯只，大鼠由河北医科大学实验动物中心提供。　　1.2药品与试剂DMEM低糖培养液、D-Hanks,fl型胶原酶干粉、Trizol均为GIBCO公司产品;胰蛋白酶干粉为Hyclone产品;新生牛血清、D一甘露醇、牛胰岛素、多聚甲醛为Sigma公司产品;双抗为In-vitrogen产品;BrdU为Boster产品;多聚赖氨酸为Amresco产品;APN抗体为Abcam产品;PCR扩增试剂为Promega产品;RT-PCR检测试剂盒为大连宝生工程有限公司产品;引物由上海生工生物工程有限公司合成;琼脂糖为北方同正产品;其它试剂均为分析纯。混合酶消化液配置方法:胰蛋白酶干粉0.08g,II型胶原酶干粉0.032g，加人37℃预热的D-Hanks液至80ml，摇匀，过滤除菌，即用即配。　　1.3心肌细胞培养取新生2}3d的SD大鼠，在无菌的条件下，开胸取出心脏，用D-Hanks液冲洗3次后剪成约1mmx1mmx1mm大小的碎块，加人棍合酶消化液，取消化完毕后的上清液，200目细胞网筛过滤，所得细胞悬液差速贴壁后以1x106/ml的密度接种于六孔板，加人5-澳脱尿昔0.1mmol/L，在二氧化碳孵育箱内以含10%血清的低糖DMEM培养基培养。　　1.4实验分组常规进行心肌细胞原代培养48h后，换为无血清的低糖DMEM培养基培养24h，将32只大鼠按随机数字表法分为4组，每组8只:(1)对照组(control:以低糖DMEM培养基培养24ho(2)葡萄糖(G)组:以30mmol/L葡萄糖干预24h，(3)胰岛素(Ins)组:以10-'mmol/L胰岛素干预24ho(4)葡萄糖+胰岛素(G+Ins)组:以30mmol/L葡萄糖和10-'mmol/L胰岛素共同干预24h。　　1.5胰岛素抵杭心肌细胞模型鉴定采用3H-D一葡萄糖掺人实验评价细胞的胰岛素敏感性。心肌细胞干预24h后各组换低糖DMEM培养液，将各刺激组再分为24h组和48h两组，每组3孔。48h组继续以低糖DMEM培养液孵育。刺激后，各组加人1ml低糖DMEM培养液再孵育半小时，然后加人'H-D-葡萄糖(1.3pa,Gi/ml培养液)继续孵育1h。洗涤细胞后将细胞溶解，取100闪测定蛋白质浓度。冷乙醇(660/ml)溶液洗涤两次，离心弃上清，将沉淀物置于滤纸片上，洗涤后烤干，置于10ml闪烁液中，用液体闪烁仪测定放射性计数，得出3H-D-葡萄糖掺人率，单位为nmol葡萄糖/(mg蛋白质·h)。　　1.6心肌细胞脂联素检测。　　1.6.1RT-PCR检测脂联素mRNA的表达引物序列如下:脂联素正义链5'-CAGGAGATGCTG-GAATGA-3'，反义链5'-GATACTGGTCGTAGGT-GAAG-3';(3-actin正义链5'-AGGGAAATCGTGCGT-GAC-3'，反义链5'-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3'按照Trizol试剂说明书提取心肌细胞总RNA并进行逆转录反应，共35个循环，PCR产物10闪经2%琼脂糖凝胶电泳，嗅化乙锭染色、照相并经光密度仪扫描分析，以p-actin光密度值进行标准校正，计算}P\产物的相对量:　　1.6.2心肌细胞脂联素蛋白表达水平的检测裂解液裂解细胞后进行聚丙烯酸胺凝胶电泳。利用水浴式电印迹法将蛋白转至PVDF膜上，室温下封闭4h后，加人兔抗.1PN多克隆抗体稀释液，4℃过夜，用含体积分数为0.5%Tween-20的PBS缓冲液(TPBS)洗3遍，再加人荧光染料标记的羊抗兔IgG(1:5000，RocklandIRDve800C)二抗稀释液，37℃振摇1h后用TPBS液洗3遍，用Odyssey9120双色红外激光成像系统仪器扫描PVDF膜后用成像分析软件进行分析，计算每组与汗actin表达量的比值。　　1.7统计学处理应用SPSS13.0进行统计分析，计量资料以x士、表示，计量资料组间比较采用t检验，两变量间相关性用直线相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1心肌细胞3H_D_葡萄糖掺入率的变化干预24h后，G组心肌细胞}H-D一葡萄糖掺人率与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05);Ins组心肌细胞3H-D一葡萄糖掺人率较对照组显著下降(P<0.01);6+In、组心肌细胞3H-D一葡萄糖掺人率较对照组显著下降(P<0.01)。干预48h后，G组心肌细胞3H_D_葡萄糖掺人率与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.OS);Ins组心肌细胞3H-D一葡萄糖掺人率较对照组显著下降(P<0.01);G+Ins组心肌细胞3H-D一葡萄糖掺人率较对照组显著下降(P<0.O1)。见表1。　　2.2心肌细胞脂联素mRNA表达的变化应用高糖、高胰岛素、高糖+高胰岛素干预48h后，G组心肌细胞脂联素表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.OS);Ins组心肌细胞脂联素表达较对照组显著下降(P<0.05);G+Ins组心肌细胞脂联素表达较对照组显著下降(P<0.05,P<0.01)见图1,表2。　　2.3心肌细胞脂联素蛋白表达的变化应用高糖、高胰岛素、高糖+高胰岛素干预48h后，G组心肌细胞脂联素表达较对照组显著减低(P<0.O5);Ins组心肌细胞脂联素表达较对照组显著下降(p<0.01);G+Ins组心肌细胞脂联素表达较对照组显著下降(P<0.01)。见图2、表2。　　2.4心肌细胞3H_D_葡萄糖掺入率与心肌细胞脂联素mRNA表达量间的相关分析应用高糖、高胰岛素、高糖+高胰岛素干预48h后，对照组、G组、Ins组、G+Ins组3H-D一葡萄糖掺人率与心肌细胞脂联素mRNA表达量均呈直线正相关(r=0.92,0.82,0.89,0.86，P<0.O5)。　　3讨论　　胰岛素抵抗是指机体对胰岛素生理作用的反应性降低或敏感性降低。产生胰岛素抵抗的主要部位在肝脏、肌肉和脂肪组织。临床研究发现，约25%的正常人群存在胰岛素抵抗，糖耐量减低人群75%存在胰岛素抵抗，2型糖尿病患者胰岛素抵抗的发生率为85%左右。研究胰岛素抵抗机制以及药物对胰岛素抵抗的影响离不开胰岛素抵抗细胞模型，因此建立可靠的模型极为重要。目前已成功复制出数种IR细胞模型，这些细胞模型主要有:地塞米松诱导模型、高胰岛素诱导培养模型、高类固醇培养模型、肿瘤坏死因子诱导模型、游离脂肪酸诱导模型等，其中以高胰岛素培养模型最为稳定、可靠，使用也最为广泛。目前已知与胰岛素抵抗相关的最重要部位是代谢较旺盛的肝脏、骨骼肌、脂肪心肌也是人体代谢最旺盛的器官之一有学者发现，胰岛素受体同样在心肌细胞表面表达，其受体数目受胰岛素水平的调节当胰岛素受体数目下调至一定程度时，则该细胞刘一胰岛素的作用产生抵抗2有学者在研究犬体外循环心肌缺血一再灌注损伤时发现，在此强应激过程中，不仅机体全身发生了胰岛素抵抗，而且作为胰岛素靶组织之一的心肌也发生了胰岛素抵抗3。有研究在糖尿病高血糖状态下对心肌细胞进行研究，发现高血糖激活了细胞多元醇代谢通路，最终导致肌醇代谢紊乱、细胞内Na十-KT-ATP酶活性下降、钙离子泵功能障碍，葡萄糖转运异常，引起心肌细胞结构与功能受损。但目前针对心肌细胞的胰岛素抵抗研究，国内外尚未见报道。　　因此，胰岛素抵抗心肌细胞模型的建立对研究心肌细胞局部胰岛素抵抗的发生机制具有重要意义。　　胰岛素抵抗的代表性特征是高胰岛素血症、高血糖症和内环境紊乱等。高血糖、高胰岛素血症本身可能诱导IR的发生。因此，笔者采用高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素诱导心肌细胞，排除机体全身体液、神经调节的因素影响，进一步探讨高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素对体外心肌细胞胰岛素敏感性的影响。3H-D一葡萄糖掺人实验是目前较为常用的评价细胞胰岛素敏感性的方法之一。脂联素被认为是胰岛素抵抗的标记物。有研究表明高脂饲料喂养的胰岛素抵抗大鼠模型内脏脂肪组织脂联素表达减低，罗格列酮干预后可上调脂肪组织脂联素的表达，降低空腹胰岛素水平，改善胰岛素抵抗。　　脂联素基因敲除的纯合子小鼠可表现出中度的胰岛素抵抗及轻度的葡萄糖耐量低减，提示脂联素具有纠正胰岛素抵抗的作用;单次给予脂联素后，高脂高蔗糖饮食小鼠血中脂肪酸和甘油三醋明显降低、体重增加。上述研究表明脂联素与胰岛素敏感性密切相关，脂联素表达水平越低，胰岛素抵抗越严重。而笔者前期研究已经明确心肌细胞亦能表达脂联素。　　笔者运用高葡萄糖、高胰岛素、高葡萄糖+高胰岛素三种方法诱导心肌细胞，结果表明三组心肌细胞脂联素表达均下降。但高葡萄糖诱导法3H-D一葡萄糖掺人率与心肌细胞脂联素mRNA表达与对照组差异无统计学意义(P>0.05，未能诱导出胰岛素抵抗。而高胰岛素诱导法、高葡萄糖+高胰岛素法均可促使3H-D-葡萄糖掺人率显著下降、葡萄糖摄取障碍的发生、脂联素表达下降，促使细胞发生胰岛素抵抗。同时，三个实验组中’H-D-葡萄糖掺人率与心肌细胞脂联素表达均呈显著正相关，进一步证明了心肌细胞脂联素是心肌细胞胰岛素抵抗的标志物。胰岛素抵抗不一定都伴有高血糖，高葡萄糖+高胰岛素诱导的胰岛素抵抗心肌细胞更符合高血糖伴胰岛素抵抗的2型糖尿病机体的内环境状态，更适合作为研究2型糖尿病的心肌细胞模型。　　参考文献　　Nikolaidis LA,Levine TB. 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