细胞周期与视网膜色素上皮细胞的生长

　　作者：左玉霞，马素红，郑燕林

　　【摘要】 目前玻璃体视网膜手术在治疗PVR方面取得了巨大成功但是手术并不能完全阻止甚至可能刺激RPE细胞的迁移和增殖，从而导致PVR的复发。RPE细胞是参与PVR形成的一种重要细胞，因此有关药物抑制RPE细胞增殖的研究受到重视，本文综述了近年来影响RPE细胞周期药物的研究进展.展望了通过调控RPE细胞周期来抑制细胞增殖以防治PVR 的前景。

　　【关键词】 细胞周期

　　0引言

　　在病理情况下，视网膜色素上皮(RPE)细胞在多种生长因子、趋化因子及黏附分子等的协同作用下，移行至玻璃体腔内、视网膜下和视网膜表面，重新进入细胞周期，开始增生，分泌一系列细胞因子及细胞外基质，最终形成牵拉性膜，导致牵拉性视网膜脱离。因此，如何通过调控RPE细胞周期来抑制细胞增殖可能是防治PVR 的一种新策略。

　　1细胞周期及调控

　　1.1细胞周期 细胞周期(cell dividing cycle)[1]指细胞从一次分裂结束开始生长到下一次分裂终止所经历的过程。细胞周期的概念由Howard和Pelc 1951年首次提出，并将细胞周期分为间期(G0)与分裂期，间期包括DNA合成前期(G1期)，DNA合成期(S期)，DNA合成后期(G2期);分裂期(M期)又分为前期、中期、后期和末期。Lajtha还提出细胞周期中存在一个G0期，此期细胞不参加细胞增殖，适当刺激后可以重新加入细胞周期开始分裂。各种细胞的周期时间不同，差异主要在于G1期的长短不同，在离体培养条件下可通过控制外在条件使细胞分裂减慢或停止，但无论采用什么手段均停顿在G1期，这表明，细胞一旦通过G1期就注定要完成S、G2、M期。M期所持续的时间较短，一般为30～60min;分裂间期的时间跨度较长，根据细胞的类型和所处的条件不同而不同，有几小时、几天、几周或更长。细胞周期所持续的时间一般为12～32h，人的细胞周期约为24h：分裂期30min，G1期9h，S期10h，G2期4.5h。

　　1.2细胞周期调控 细胞之所以能够忠实的复制，依赖于细胞周期蛋白(cyclin)对细胞周期蛋白依赖性激酶CDK(cell dependent kinase)的激活和抑制物对它的抑制，以及细胞周期检查点的监控。

　　1.2.1细胞周期调控因子 ①CDK：CDK是一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要生物学作用是启动DNA的复制和诱发细胞的有丝分裂，以复合物形式出现，该复合物分为催化亚基和调节亚基两部分，催化亚基为CDK,调节亚基为细胞周期蛋白。CDK活性调节方式主要有3种：第1种是磷酸化和脱磷酸化调节，第2种是由调节亚基cyclin起作用，只有与cyclin结合后，CDK才有活性，第3种是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(CKI)的调节作用。②cyclin：cyclin细胞周期蛋白是一类随着细胞不同时相而发生的蛋白质，主要有5种：A、B、C、D、E，它们能与CDK结合，根据cyclin调控细胞周期时相的不同，分为G1期和M期。G1期细胞周期蛋白包括C、D、E 3种，在G1期和G1/S交界处发挥作用，启动细胞周期并能促进DNA合成。M期细胞周期蛋白包括A、B两种，在G2/M交界处发挥作用，诱导细胞分裂。

　　1.2.2细胞周期调控 细胞周期通常存在2个检测点，即DNA合成开始的G1-S检测点和有丝分裂的G2-M检测点。这2个检测点可发生DNA的损伤和突变，从而将受损细胞阻滞在细胞周期相应的时相进行DNA修复，无法修复的细胞则发生凋亡或死亡[2]。G1期合成的专一蛋白称为触发蛋白(Trigger protein)，触发蛋白的积累有助于细胞通过G1期R点进入S期，G1期之末是推进细胞周期的一个关键时刻，也是药物作用于细胞周期的一个敏感点。P21WAF1P27Kip1及c-myc蛋白为细胞中G1-S检测点的重要调节因子[3]，其中前两者属细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族CKI,主要通过抑制G1-S检测点中各种周期蛋白及其依赖性激酶来调节细胞周期[4]。近几年研究发现，不管cyclin、CDK和CKI，还是其他相关因子对细胞周期的作用都是通过视网膜母细胞瘤基因产物Rb蛋白来实现，Rb蛋白对细胞周期中最为关键的两个调控点Gl-S和G2-M起到一种“闸门”的作用，在G1和G2期，Rb蛋白上的多个磷酸化位点都处于非磷酸化或低磷酸化状态，与转录因子E2F结合成复合物形式，抑制与细胞周期相关基因的转录表达，发挥稳定的细胞周期抑制作用，在G1和G2末期，控制该调控点的相应细胞周期蛋白合成增加，与相应的CDK结合，使Rb蛋白磷酸化，从而导致E2F的释放，游离的E2F启动多种基因的转录表达。因此，Rb蛋白的功能状态最终决定着细胞周期的进程[5]。

　　2对RPE细胞周期影响的药物

　　近年来诸多学者以细胞周期阻滞为着眼点研究抗细胞增殖的药物，目的是通过药物作用影响细胞的DNA合成或有丝分裂的进行而调控细胞周期，将细胞阻滞在某一期，阻止细胞重新进入细胞周期，从而抑制细胞增殖的发生。

　　2.1将细胞周期阻滞在G0-G1期的药物 维甲酸(retinoic acid，RA)，是感光细胞的中间代谢产物，也是维生素A在体内的自然衍生物。维甲酸类药物后来被发现具有抑制RPE细胞增殖的作用。其作用机制为维甲酸进入细胞后首先与细胞质内的维甲酸结合蛋白(cRABP)结合，再被转运至细胞核内，在细胞核内有3种维甲酸受体，维甲酸与其受体结合呈二聚体调节关键酶(如鸟氨酸脱羧酶及蛋白激酶C)基因的表达，可明显抑制与细胞增殖有关的c-myc、c-myb基因的异常表达，并且可以与某些靶基因序列结合进而调节某些基因的转录，抑制细胞DNA合成，从而抑制细胞增殖，促进细胞分化[6]。国内喻晓兵等[7]通过研究维甲酸对体外培养兔视网膜色素上皮合成的影响，认为维甲酸是通过抑制RPE细胞周期中S期DNA合成来抑制细胞生长，其作用浓度为10-9～10-5mol/L,并且呈量效关系。Doyle等[8]认为维甲酸对于牛兔原代培养的RPE细胞无明显的抑制作用，但在人原代培养的RPE细胞确有明显的抑制作用。维拉帕米(vera pamil,Ver)是一类能够阻断慢钙通道、减少细胞外液Ca2+内流的药物。而Ca2+是细胞内的第二信使及细胞增殖的启动子，其浓度的升高能导致细胞有丝分裂的发生。余建洪等[9]利用MTT比色法和氚标胸腺嘧啶核苷(3H-thymidine, 3H-TdR)掺入试验测定维拉帕米在一定浓度内能抑制培养的hRPE细胞的增殖和DNA合成最大抑制率为79.54%，姜彩辉等[10]试验也有类似的结果，并且发现可使兔RPE细胞更多地滞留在G1期,阻止细胞进入S期,且具有明显的浓度依赖性和时间依赖性。

　　槲皮素(QUE)对多种与细胞增殖有关的酶都有抑制作用。QUE可通过抑制蛋白激酶C和线粒体琥珀酸氧化酶而抑制肿瘤细胞的增生[11],直接与钙离子—钙调素复合物反应拮抗钙调素的作用,抑制肿瘤细胞DNA合成。QUE可直接与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-knase)的ATP结合位点结合抑制该酶的活性,并能竞争性抑制酪氨酸蛋白激酶活性,从而影响多种生长因子的信号传递,进而抑制细胞的分裂增生。国内张培霖等[12,13]在实验中发现QUE对RPE细胞DNA合成具有明显的抑制作用，其抑制效应在一定的时间和剂量范围内有时间依赖和剂量依赖关系，在进一步的实验中运用流式细胞仪测定QUE能以剂量依赖方式使RPE细胞阻抑于G1期。

　　二甲基亚砜(DMSO,一种细胞分化诱导剂及端粒酶抑制剂) ,作为一种细胞分化诱导剂而广泛应用于研究诱导肿瘤细胞分化来治疗各种肿瘤。研究表明,DMSO诱导细胞分化的机制主要是抑制c -myc基因表达,抑制DNA合成和降低内源性聚腺苷二磷酸核糖的水平。彭坤等[14]尝试应用DMSO作用于培养的人RPE细胞，采用流式细胞术对细胞周期的研究表明，DMSO能使细胞周期发生明显变化，随DMSO浓度增加及作用时间延长,G1期细胞明显增加,S、G2期细胞显著减少,与同等条件下MTT法检测细胞存活率下降结果相符。

　　地塞米松(DEX)有强大的抗炎作用和对细胞增殖的抑制作用已广泛应用于玻璃体手术的辅助治疗。刘兵等[15]检测地塞米松对培养的人视网膜色素上皮细胞的调控。实验显示,DEX浓度小于320mg/L时,DEX对培养的人RPE具有促增殖作用,并呈时间及剂量依赖性,DNA合成增加,S、G2/M期细胞数较对照组增加28.32%,相反当浓度大于320mg/L时,能明显抑制细胞的增殖,DNA合成减少，S、G2/M期细胞数显著性降低41.84%。地塞米松对细胞生长的双向作用也见于培养的皮肤成纤维细胞和结膜成纤维细胞[17],机制尚不十分清楚。DEX具有生长因子的特性,增殖作用是由于糖皮质激素受体的激活,对一些细胞有促有丝分裂作用[16]。抑制作用可能是降低细胞膜或糖皮质激素受体的易感性[17]。

　　闻慧等[18]运用流式细胞仪测定组织型纤溶酶原抑制剂可通过延长或阻滞人RPE细胞于S期抑制其增殖，但抑制机制还不清楚。刘少山等[19]应用透明质酸刺激活性物作用于人视网膜色素上皮细胞，结果显示透明质酸刺激活性物作用后G1期细胞数较对照组增加7.2%,S期减少9.7%。赵宏等[20]用不同浓度的TGF-β1作用于RPE细胞后，培养的人RPE细胞在G1期细胞数明显增加，G2期和S期细胞数明显减少，因此认为TGF-β1抑制RPE细胞的增殖作用在本实验中已得到证实,它对RPE细胞的抗增殖作用机制是由于该细胞因子使RPE细胞阻滞在G1期而无法进入增殖期[21]。

　　2.2将细胞周期阻滞在G2/M期的药物 机制可能是药物作用于细胞骨架的微管系统，促进微管聚合并稳定微管结构，阻止其解聚成亚单位，进而影响微管聚合与解聚的动态平衡，导致细胞周期阻断在G2/M期。

　　在眼科领域，Wagner等[22]研究发现Ca2+和钙调素抑制剂可抑制RPE细胞增殖[23]。钙调素(camo- dulin,CaM)是细胞内Ca2+的主要受体,在细胞增殖、运动、分化、转化，程序性死亡中起重要作用,特别是在细胞周期中，CaM可通过以下3个环节调节细胞增殖：①促进G2/S期过渡，启动DNA合成。②促进G2/M期过渡，启动有丝分裂。③促进M中期进入M后期，完成染色体分离，结束有丝分裂。钙调素抑制剂—三氟拉嗪(TFP)是一种噻吩类化合物，现在普遍认为TFP等CaM抑制剂对细胞增殖的抑制作用是通过CaM对细胞周期的调节来实现的，主要通过CaM结合蛋白及依赖CaM的蛋白激酶和磷酸酶可逆地调节胞内周期相关蛋白的磷酸化和去磷酸化以调节胞内基因表达等反应，陈君等[24]在实验中发现TFP可抑制RPE细胞生长，且呈时间剂量效应。TFP通过对RPE细胞周期各时相群体的影响，使G1期向S期，进而向G2/M期的过渡被抑制，从而抑制RPE细胞的增殖。Kang等[25]在研究丝裂霉素(MMC)对人视网膜色素上皮细胞抑增殖的机制中发现其抑制人视网膜色素上皮细胞增殖呈剂量依赖关系。10g/L的MMC对细胞有凋亡作用，1g/L的MMC可以阻滞细胞于G2/M期，MMC可能通过P21的上调引起细胞阻滞于G2/M期。

　　康军等[26]在实验中发现苏拉明可以剂量依赖性的抑制PDGF和IL-1β的促增殖作用，在适当浓度时无细胞形态的明显变化，说明苏拉明抑制细胞增殖的能力并非毒性反应。

　　Yoon等[27]在实验中发现染料木黄酮对RPE细胞的抑制作用呈现剂量时间依赖关系[28]。10mm染料木黄酮未引起细胞凋亡，将细胞阻滞在G0/G1，使S期的细胞在24～48h内不占比例;而50μmol/L的浓度使RPE细胞阻滞在G2/M期并引起了随之而来的细胞凋亡。与Krott等和国内王海燕等的研究结果类似。发生机制是诱导G2/M期细胞阻滞的CDC2 Kinase的洛氨酸残基干扰了磷酸化和去磷酸化，进入S期和由G2进入M期与PP34cdc2的磷酸化和去磷酸化有关，而且络氨酸磷酸酶刺激物诱导了短时的G2/M期细胞的阻滞。但关于染料木黄酮诱导细胞凋亡的机制，目前尚未完全明了，可能通过抑制PTK和DNA拓扑异构酶II干扰细胞周期，使细胞生长的重要蛋白质其络氨酸残基不能发生磷酸化以及复制、转录受到抑制，扰乱细胞的分化，从而诱导细胞凋亡。

　　3问题与展望

　　通过调控RPE细胞的细胞周期来防治PVR可能是一条有效的途径，因此进一步研究开发对RPE细胞无细胞毒作用，只作用于异常增殖的细胞，且其调控作用有可逆性的药物将会为临床防治PVR提供很大帮助。

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