微量全氟加萘对家兔视网膜毒性作用的观察

　　作者：左 玲 王桂云 车松天 赵惠敏 裴 颖 作者单位：吉林大学第二医院眼科,吉林 长春 130041

　　【摘要】目的 研究微量全氟加萘(PFD)对视网膜的毒性作用，为临床应用提供实验性参考依据。方法 将30 μl的PFD及BSS液体分别直接注射到家兔视网膜表面。注射液体后每天用检眼镜观察家兔视网膜情况;在注射后的4、7、14、21 d，分别对每个实验组及对照组做光学显微镜及透射电镜的视网膜组织切片观察。结果 所有实验样本检眼镜检查及光镜病理组织学检查在各个时间点均正常，未发现视网膜有任何病理改变。透射电镜检查，4 d时，没有对视网膜造成实质性的损害;从7 d开始，各个实验组的视网膜都出现了光感受器外节、外丛状层的损害，光感受器变性，内核细胞囊泡形成，神经节细胞受损，内层视网膜坏死，视网膜内吞噬细胞反应，视网膜色素上皮细胞吞噬膜盘，顶部微绒毛脱落等病理变化。结论 微量的PFD存在于眼内，视网膜可出现超微结构的病理改变，但无显微结构的变化，在宏观上也无任何改变。视网膜毒性作用随着残留时间的延续而加大。提示眼内微量残留PFD应该在4 d之内取出。

　　【关键词】 全氟加萘 视网膜 病理学

　　对一些复杂的玻璃体视网膜疾病，如糖尿病视网膜病变、增殖性玻璃体视网膜病变等，在进行玻璃体切割的手术中常常需要用重水来压平隆起的视网膜，以便于进一步的操作。全氟加萘(perfluorodecalin，PFD)是重水的一种，由饱和碳碳和碳氟原子分子链组成的含有10个碳原子的重的惰性液体。因其独有的特性而被临床用作玻璃体手术中的“液体操作工具”〔1〕。在应用过程中发现PFD对视网膜组织有一定的毒性作用，但是关于微量PFD至少残留多长时间会对视网膜的超微结构带来损伤少见报道。本文通过对家兔玻璃体腔注射微量PFD，追踪观察视网膜超微结构的改变，旨在探讨微量PFD至少残留多长时间会对视网膜造成损害。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物、主要试剂及仪器 健康实验家兔，体重2.5 kg，雌雄各半，购于本校实验动物中心。PFD(德国)，BSS液(爱尔康公司);OMS610显微镜(日本)，100 μl微量进样器(上海)，YZ6E检眼镜(苏州)，JEM1200EX透射电镜(日本)。

　　1.2 分组及手术方法 将16只实验家兔32眼随机设为实验组12只24眼、对照组4只8眼。实验组随机分为注射PFD后的4 d组、7 d组、14 d组、21 d组，每组各3只6眼;对照组随机分为注射BSS后的4 d组、7 d组、14 d组、21 d组，每组各1只2眼。实验组给予PFD 30 μl。对照组给予等量BSS液体。实验前3 d，用0.25%氯霉素眼液点术眼。实验时美多丽P术眼散瞳，用5%乌拉坦溶液耳缘静脉注射，按5 ml/kg溶液实施全身麻醉，贝诺喜眼液点术眼角膜实施眼表麻。麻醉后，眼周碘酊消毒，铺无菌洞巾，置于显微镜下，结膜囊冲洗，用穿刺刀在距角巩膜缘2 mm的11点及1点处垂直睫状体平坦部刺向玻璃体中心，角膜上置一斜镜，将导光纤维伸入眼内。在其照明下，实验组用改良后无菌的100 μl微量进样器将30 μl已消毒的PFD注射到各实验组眼的下方视网膜表面;对照组同法注入等量BSS液体。用50的尼龙线缝合巩膜穿刺口，庆大霉素1万单位、地塞米松2 mg结膜下注射，金霉素眼膏、1%阿托品眼膏涂眼。

　　1.3 术后处理和观察 每天用检眼镜观察家兔视网膜情况;在注射PFD后的4、7、14、21 d分别对各组家兔实施全身麻醉。每只眼用直肌线固定4条直肌，在检眼镜直视下，用龙胆紫在视网膜相应的巩膜壁上标记。然后处死家兔，摘取眼球，将龙胆紫标记处的视网膜取下，在滤纸上铺平后，分成两份。一份浸泡在10%福尔马林溶液的标本瓶中并标记，然后行视网膜组织切片，HE染色，光学显微镜下观察结果;一份放入4%戊二醛溶液的标本瓶里并标记，行透射电镜组织学切片并透射电镜下观察结果。将实验组未接触过PFD的视网膜取下，同上法进行处理。

　　1.4 统计学分析 对所有实验样本视网膜透射电镜下的病理变化进行等级评定(分为5个等级)，并进行KruskalWallis检验。

　　2 结 果

　　2.1 检眼镜检查 各实验组玻璃体透明，视网膜呈橘红色反光，在其表面可见边界清晰、聚集成滴的PFD。对照组的玻璃体、视网膜未见明显异常改变。

　　2.2 视网膜组织切片HE染色结果 实验组在4、7、14、21 d时接触过PFD的视网膜组织与对照组相比均无明显改变，视网膜结构完整，视网膜各层细胞排列规则、完整，未见炎症、变性、坏死等改变(见图1、图2)。

　　2.3 透射电镜检查结果 4 d时，实验组接触过PFD的视网膜，各层结构清晰完整，细胞排列规则，形态正常，细胞膜透明，细胞完整(图3A)。7 d时，实验组接触过PFD的视网膜中，可见视杆细胞外节的膜盘排列紊乱(图3B)，细胞形态正常，结构完整。14 d时，实验组接触过PFD的视网膜中，视杆细胞外节的膜盘排列紊乱，局部均质化，色素上皮细胞顶部可见微绒毛减少(图3C)。21 d时，实验组接触过PFD的视网膜中，视杆细胞外节的膜盘排列紊乱，局部均质化，膜盘数量减少、结构不清，内节中线粒体肿胀，脊断裂，视细胞顶部胞质可见小空泡结构，内节内线粒体肿胀，可见髓样小体;色素上皮细胞顶部可见微绒毛减少;内核层的双极细胞可见空泡结构，周围轴突内可见髓样小体;节细胞可见许多空泡(图3D)。

　　2.4 统计学分析结果 KruskalWallis检验分析，有显著性差异(P=0.0187，<0.05),见表1。表1 KruskalWallis检验分析结果

　　3 讨 论

　　PFD因其独有的特性和较小的毒性作用在眼科的手术中得到了广泛应用〔2～5〕。 虽然在玻璃体手术中部分眼内注入PFD后，能取得展平视网膜的效果。但是由于术中屈光间质混浊如角膜水肿等，或手术操作不熟练、不规范，及油液界面不清导致重水的残留，对视网膜造成不同程度的损害，引起视网膜及角膜的毒性反应。应用PFD的主要并发症是在术中PFD进入视网膜下或分散成小滴,导致术后残留,产生眼内毒性〔6～9〕。

　　有人在兔眼的实验中发现重水会引起明显的玻璃体泡沫细胞反应,分散成小滴，可引起光感受器外节、外丛状层的损害和视网膜前巨噬细胞的积聚;而另外有些学者通过动物实验也指出了重水可引起视网膜内吞噬细胞反应以及光感受器、米勒细胞、外核层和神经节细胞的损害，出现泡末细胞〔10，11〕。视网膜下的重水可导致视网膜色素上皮细胞吞噬重水、光感受器变性、视网膜细胞水肿、内核细胞囊泡形成、内层视网膜坏死、进而视网膜裂孔形成〔12〕，神经细胞排列改变、轴突缺失〔13〕。

　　本实验将PFD这种目前临床上常用的全氟化碳液(PFCLs)作为研究材料。从实验结果看，在4、7、14、21 d时不论是检眼镜下直接观察视网膜，还是视网膜组织切片HE染色光学显微镜下观察，各组的视网膜都未见炎症、变性、坏死等改变，结构完整，细胞形态正常，也就是说从宏观及显微角度来说，没有发现实验组中接触过PFD的视网膜和未接触过PFD的视网膜及对照组的视网膜有任何病变。在透射电镜下，4 d之内PFD没有对视网膜产生实质性的毒性损害。从7 d开始，出现了视杆细胞外节的膜盘排列紊乱;而在14 d后，视网膜的各层相继发生非常明显的超微结构变化，出现了光感受器外节、外丛状层的损害，光感受器变性，内核细胞囊泡形成，神经节细胞损害，内层视网膜坏死，视网膜内吞噬细胞反应，视网膜色素上皮细胞吞噬膜盘，顶部微绒毛的脱落，与相关的文献报道一致〔10，12，14〕。

　　经过对实验样本进行KruskalWallis检验。可以发现，视网膜毒性反应可以随着微量PFD残留时间的延续而不断加重(P=0.0187)，视网膜的毒性反应与微量PFD的残留时间呈正相关。据此可以认为即使残留微量的PFD，长时间存留于眼内也会使视网膜发生不可逆转的损伤，进而损害视功能，表现出临床症状。虽然有临床报道称小剂量的残留重水长期在眼内存留无临床异常症状，甚至消失，因此可不必取出，但其视网膜超微结构可能已经有所变化，因此残留微量PFD的眼内毒性还有待更多的临床观察,此类患者需要密切随访。

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