小牛血清蛋白提取物对家兔角膜碱烧伤治疗机制的研究

　　作者：黄平 作者单位：辽宁医学院附属第一医院眼科,辽宁 锦州 121001

　　【摘要】 目的 探讨小牛血清蛋白提取物(deproteinised calf blood extract，DCBE)对角膜碱烧伤的治疗作用机制。方法 制作兔右眼碱烧伤模型，实验组、对照组和安慰组于烧伤后分别立即用20%小牛血清蛋白提取物、表皮生长因子和0.9%的生理盐水点眼，每日4次。分别于1、3、7、14天进行角膜荧光素钠染色照相后处死做常规HE染色病理切片和测定角膜的乳酸和丙酮酸含量。结果 碱烧伤后第1、3、7、14天，实验组、对照组和空白组在角膜荧光素钠染色，HE病理染色及乳酸、丙酮酸有显著性差异。结论 小牛血清蛋白提取物明显能抑制角膜碱烧伤后乳酸和丙酮酸的含量，进而促进碱烧伤后角膜的组织修复。

　　【关键词】 角膜碱烧伤 小牛血清蛋白提取物 乳酸和丙酮酸 作用机制

　　On the Therapeutic Mechanism of DCBE in the Cases of Corneal Alkali BurnHUANG Ping1，LIU Dan1,GU Shu-ying2(1.Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121001 China;

　　2.Department of Ophthalmology, Panjin Second Hospital of Liaoning Province, Panjin 124000 China)【Abstract】 Objective This paper has digged into the therapeutic mechanism of DCBE in corneal burn by alkali in rabbits. Methods By making the models of corneal burnt in right eye .The model rabbits were divided into three groups and tried 20% DCBE, epidermal growth factor and normal with 0.9% saline respectively through Qid eyedrop application. Then having Fluorescein Sodium dyed before killing rabbits on the 1st,3rd,7th,14th days and HE dyeing and lactic acid and pyruvic acid were measured after killing rabbits. Results On the 1st,3rd,7th,14th days after being burnt, the rabbits' level of Fluorescein Sodium dyeing, HE dyeing in the experimental group was markedly higher than others and level of lactic acid and pyruvic acid in the experimental group was markedly lower than that of others. Conclusions DCBE has inhibited the level the of lactic acid Pyruvic Decarboxylaseand pyruvic acid after the Corneal Alkali Burn, thereby can obviously promote the corneal repair after alkali burn.

　　【Key words】 Corneal Alkali Burn; DCBE; Lactic acid and Pyruvic acid ;Therapeutic Mechanism

　　眼部碱烧伤是临床工作中常见比较难处理的眼表疾病。角膜碱烧伤可导致角膜溶解、新生血管形成及溃疡穿孔等严重病理改变[1]。严重的碱烧伤，预后特别影响患者的视力，如何能促进角膜碱烧伤既快又好的治愈，是许多学者一直研究的课题。小牛血清蛋白提取物已经在眼科广泛应用，但其作用机制尚未明了，本实验通过设立对照组和空白组来探讨小牛血清蛋白提取物眼膏在角膜碱烧伤中的治疗作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物模型及实验方法选择健康白色日本大耳白兔，体重1.0～1.2 kg,雄雌各半，眼部检查正常者用于实验。60只兔随机分为试验组，对照组和空白组，每组20只。3%戊巴比妥钠静脉麻醉家兔(30mg∕kg),1%丁卡因眼液点眼3次,取直径为5mm的圆形滤纸，浸透0.5mol/L NaOH，纸片置于兔角膜中央lmin后取下，使角膜达到III级烧伤程度(烧伤程度根据全国眼外伤职业病学组通过的烧伤标准[2])。立即用100mL生理盐水冲洗结膜囊及眼表至pH接近7.0 。可见一个边界清晰，直径5mm圆形角膜碱烧伤区。伤后结膜囊涂红霉素眼膏防止继发感染，1%阿托品眼液滴眼。制成的动物模型的3组中，实验组、对照组和安慰组于烧伤后分别立即用20%小牛血清蛋白提取物眼膏(由锦州奥鸿药业提供)、表皮生长因子和0.9%的生理盐水点眼，每日4次。

　　1.2 角膜荧光素染色及面积和上皮愈合率计算3组分别做角膜荧光素染色，裂隙灯显微镜观察角膜着色情况，典型图片分别于治疗后1天、3天、7天、14天数码相机拍照，图片输人计算机图形分析系统，鼠标连线测量荧光着色区直径和横径，根据直径×横径×π4mm2[3]计算角膜着色面积。角膜上皮愈合率=0天着色面积-观察时着色面积0天着色面积×100%。结果进行统计学分析。

　　黄平，等.小牛血清蛋白提取物对家兔角膜碱烧伤治疗机制的研究辽宁医学院学报 2007年8月，28(4)1.3 角膜HE染色和乳酸及丙酮酸测定在第1、3、7、14天处死分别取下兔子的角膜，1/2角膜经福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，进行常规HE染色，其余1/2角膜用0.9%生理盐水冲洗后放入-70℃冷藏，等全部取下来后用751型分光光度计进行角膜乳酸和丙酮酸的测定。(试剂盒由南京生物医学工程研究所提供，严格按试剂盒的说明操作)。

　　1.4 统计方法采用spss11.5软件包进行统计学分析。所有数据均采用均数±标准差(±s)表示，数据分析采用方差分析及q检验。

　　2 结 果

　　小牛血清蛋白提取物和表皮生长因子及生理盐水在治疗家兔角膜碱烧伤时角膜上皮愈合率有显著性差异，如表1，尤其在角膜碱烧伤前3天，小牛血清蛋白提取物和后两者统计学都有显著性差异。表1 小牛血清蛋白提取物和表皮生长因子点眼后角膜上皮愈合率比较同一天与对照组比较，P<0.05 b:同一天与对照组比较，P<0.01 c;同一天与表皮生长因子比较，P<0.01家兔角膜碱烧伤后，用小牛血清蛋白提取物治疗后，角膜的乳酸和丙酮酸的含量明显比其余两组的低，如下表2、3所示，统计学有显著性差异。表2 碱烧伤后各组角膜的乳酸含量(mmol/gprot)时间点(天)小牛血清蛋白提 a:同一天与对照组比较，P<0.05 b:同一天与对照组比较，P<0.01 c;同一天与表皮生长因子比较，P<0.01, d：同一天与表皮生长因子比较，P<0.05表3 碱烧伤后各组角膜的丙酮酸含量(μmol/gprot)时间点(天)小牛血清蛋白提

　　3 讨 论

　　眼前节碱烧伤的治疗原则，关系重要的是紧急抢救，其次是改善营养紊乱，减轻炎症反应，创造条件使眼部组织迅速而无并发症的愈合[4]。自从1969年Brown[5]首先发现碱烧伤后，角膜组织中胶原酶活性升高以来，许多作者把注意力集中在胶原酶抑制剂上[6]，但失败的比例仍很大，而且用药的频度及这些药物的某些毒性作用等，限制了它们的使用[7]。另外，严重碱烧伤后，房水和角膜及房水中葡萄糖含量在伤后24～72h已显著降低，而且至少持续1～2周[8]说明碱烧伤后局部呈代谢紊乱，各种营养物质缺乏。Pfister等[9]用放射标记的脯氨酸示踪胶原的合成，发现几乎没有成熟的胶原，局部的严重营养不良使胶原合成的质和量均下降、加速了角膜溃疡的发生。因此，在碱烧伤时加强局部营养治疗是非常重要的。小牛血清提取物是从发育旺盛的小牛血清中提取的低分子量物质，分子量为2 500～3 000，其中有机物占30%，无机物占70%，有机成分中除含有氨基酸类、肽类、核酸关连物质、糖类及有机酸外，还含有多数未明成分。小牛血去蛋白提取物可通过增加线粒体的呼吸能力和高能磷酸的合成而促进细胞对氧的利用, 它对氧的摄取和ATP 合成的促进作用是呈剂量依赖性的。在缺血、缺氧状态下,组织细胞内的葡萄糖发生无氧酵解,会产生大量乳酸,进而导致细胞丧失功能,最终死亡。小牛血去蛋白提取物可促进组织细胞对氧和葡萄糖的摄取与利用,使葡萄糖由无氧酵解向有氧氧化转化, 在有氧氧化的状态下不仅ATP 的合成增加, 而且代谢的最终产物为对组织细胞无害的二氧化碳和水, 从而改善了细胞的能量代谢和功能状态, 延长了细胞在缺氧状态下存活时间[10]。小牛血清蛋白提取物刺激细胞色素氧化酶的生理功能，并能促进上皮细胞的能量代谢，减少组织粘膜的乳酸和丙酮酸的积蓄，能更好地促进组织修复[11]。本实验结果表明，小牛血清蛋白提取物制成的眼膏作用机制就是抑制角膜碱烧伤后乳酸和丙酮酸的含量，能提供角膜营养和氧，使葡萄糖由无氧酵解向有氧氧化转化，加上小牛血清蛋白提取物眼膏具有很大的粘附性，可使其在角膜表面形成一层具有润滑作用的保护膜，避免了眼睑对角膜上皮创面的机械性磨擦作用，明显促进角膜碱烧伤后的愈合(图1，2，3，4)。在治疗角膜疾病，尤其是角膜碱烧伤取得满意的疗效。

　　【参考文献】

　　[1] 李钫，邢怡桥，杨燕广，等.羊膜移植对碱烧伤小鼠角膜基质金属蛋白酶表达的影响及其意义[J]. 现代医学，2005，33(1)：7-9.

　　[2] 全国眼外伤职业病学组.眼部烧伤分度标准[J].眼外伤职业眼病杂志，1983, 5:封三.

　　[3] 于纯智.化云宁治疗角膜瘢痕的疗效[J].第四军医大学学报，1988，9：2-5.

　　[4] 陈剑.眼前节碱烧伤的治疗[J].实用眼科杂志，1992，10(5):262.

　　[5] Brown SI, Weller CA, Wassermann HE. Collagenolytic activity of alkali-burned corneas[J]. Arch Ophthalmol ，1969，31: 370.

　　[6] Brown SI, Akiya S, Weller CA. Prevention of the ulcers of alkali一burned cornea. Preliminary studies with collagense inhibitions[J]. Arch Ophthalmol， 1969，82: 95.

　　[7] Sugar A, Waltman SR. Corneal toxicity of collagenase inhibitors[J]. Invest Ophthalmol， 1973，12: 779.

　　[8] 宋深.兔眼前节碱烧伤实脸研究[J].眼外伤与职业性眼病杂志，1984，4(4) :188.

　　[9] Pfister RR. Clinical injuries of the eye[J]. Ophthalmol， 1983， 90: 1246.

　　[10] 丁亚军,王莹,王洪新，等.奥德金的基础研究和临床应用评价[J].中国医院用药评价与分析， 2002 ，2 (1)：17.

　　[11] 彭穗英，曾怡谋，素高捷疗眼膏治疗泪道阻塞临床观察[J].眼外伤职业病杂志，1999，21(1)：72-73