人骨髓间充质干细胞在兔角膜缘干细胞缺损动物模型中的分化

人骨髓间充质干细胞在兔角膜缘干细胞缺损动物模型中的分化 作者：蒋自培，胡赛静，徐建国，孔丽萍，吴文栩，瞿佳    作者单位：1.温州医学院附属第一医院 眼科，浙江 温州 325000；2.温州医学院附属眼视光学院，浙江 温州 325027    【摘要】  目的 探讨人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化为角膜上皮细胞的可塑性及可行性。方法 20只日本大耳白兔随机分为对照组和实验组，每组10只，右眼为实验眼。实验组：将人MSCs接种在人羊膜上培养4 d后移植到兔角膜缘干细胞缺损的动物模型；对照组：仅采用羊膜移植到兔角膜缘干细胞缺损的动物模型。分别于移植后第1、第2、第3、第4和第6周，摘取各组眼球，分别行HE和PAS染色、单克隆抗体AE1和PCNA染色、透射电镜和扫描电镜检查。结果 人MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长，与羊膜共培养4 d后，人MSCs贴附羊膜生长迅速，组织学特征无明显改变。羊膜负载人MSCs移植到兔角膜基质表面，角膜表层细胞PAS染色呈阴性，AE1和PCNA染色呈阳性，具有典型的上皮细胞形态；而对照组PAS染色呈阳性，AE1和PCNA染色呈阴性。超微结构观察可见，实验组电镜下可见微绒毛、桥粒和张力丝等典型上皮细胞结构，而对照组未见以上明显特征。结论 羊膜负载人MSCs移植到兔眼表角膜基质后，MSCs能存活、增殖并向角膜上皮样细胞分化。    【关键词】  骨髓间充质干细胞；角膜上皮细胞；分化    Study of the transdifferentiation of human mesenchymal stem cells in the surface of the cornea of a rabbit model with limbal stem cell deficiency　JIANG Zipei， HU Saijing， XU Jianguo， et al.　Department of Ophthalmology， Affiliated First Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou China， 325000　　Abstract］Objective  To explore the plasticity and feasibility of the transdifferentiation of human mesenchymal stem cells (MSCs) into corneal epithelial cells. Methods  Twenty Japanese white rabbits were randomly divided into 2 groups， 10 rabbits for each group； the right eye was the experimental eye. Human MSCs combined with amniotic membrane were transplanted onto the eyes of the experimental animals， and the controls were transplanted with the amniotic membrane only. The MSCs were cultured on human amniotic membrane for 4 days， then the cells were transplanted onto the surface of the cornea of rabbits with limbal stem cell deficiency. The eyeballs were removed after 1， 2， 3， 4 and 6 weeks. The growth and differentiation of human MSCs were observed with HE and PAS staining， monoclonal antibodies with AE1 and PCNA staining， and scanning and transmission electron microscopy. Results  When the human MSCs cultured on amniotic membrane were transplanted onto the surface of the cornea of the rabbits， the cells can adhere to human amniotic membrane and grow rapidly， showing no obvious change in histology. The cells of the corneal surface layer of the experimental group were negative to PAS staining and positive to AE1 and PCNA staining in the monoclonal antibodies， as revealed by immunohistochemical examination. In contrast， they were positive in PAS staining and negative in AE1 and PCNA staining in the controls. Compared to the control group， typical epithelium cells with large quantities of microvilli， desmosomes and tonofilaments were observed under the electron microscope in the experimental group. Conclusion  The data suggests that when human amniotic membrane with MCSs is transplanted into the rabbit model with limbal stem cell deficiency， the MSCs can survive， proliferate and differentiate into corneal epithelium-like cells. 　［Key words］mesenchymal stem cell； corneal epithelial cell； transdifferentiation    角膜上皮再生的来源是角膜缘干细胞，角膜缘干细胞的缺失会导致严重的眼表疾病。采用自体或同种异体角膜缘移植，可在一定程度上重建眼表，但因供体来源不足及异体移植引起的排斥反应而受限；而单纯羊膜移植重建眼表，因缺乏发展为角膜上皮细胞的角膜缘干细胞则不能治疗严重的眼表损伤。组织工程技术的发展为解决这一问题带来了希望。最近研究发现，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是成人骨髓中存在着的多潜能性干细胞[1]，在体外不同条件下可以被定向地诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌键及骨髓基质等不同细胞[2-3]，这类细胞来源确切、充足，取材方便，避免了胚胎干细胞可能存在的伦理问题，并且具有免疫赦免的特性[4]，可为角膜缘干细胞缺损的患者提供良好的材料来源。人MSCs在体内是否能够分化为角膜上皮细胞，国内外少见报道。因此，我们对人MSCs向角膜上皮细胞的分化潜能做一些初步的研究，从而探讨人MSCs作为构建组织工程化角膜的种子细胞的可行性。1  材料和方法　　1.1  材料　　1.1.1  实验动物　　健康成年日本大耳白兔20只，雌雄不分，体重2.0～3.0 kg(温州医学院实验动物中心提供)。　　1.1.2  人MSCs　　人MSCs由温州医学院附属第一医院科研所提供，细胞鉴定采用流式细胞仪检测细胞表面标志CD44、CD90及CD147为阳性，CD34、CD38、CD45及HLA2 DR均为阴性；培养细胞可体外诱导成脂肪细胞、上皮细胞和成骨细胞等。据此可以证实所供细胞为人MSCs。　　1.1.3  羊膜 　　羊膜来自于我院剖宫产产妇的新鲜胎盘，孕妇产前排除乙肝、丙肝、爱滋病和梅毒等传染性疾病。在无菌条件下，用含有双抗和二性霉素B的PBS处理后将其贴附于硝酸纤维素膜上，并剪成2.0 cm×2.0 cm大小，放入含有甘油+DMEM培养基（V/V，1∶1）的大口无菌瓶中，密封后放入-20℃的冰箱冷冻保存以备用。　　1.1.4  仪器和试剂  　　1.1.4.1  主要仪器 　　荧光显微镜（TE300，Nikon，日本），透射电子显微镜（JEOL-1230型，日本），扫描电子显微镜(XT-30，荷兰)。　　1.1.4.2  主要试剂 　　AE1，特异性识别一组酸性角蛋白的鼠单克隆抗体（一抗，美国纽约大学TT Sun教授馈赠）；Mouse Anti-PCNA，抗增殖细胞核抗原鼠单克隆抗体（一抗，武汉博士德公司）；FITC标记的羊抗鼠单克隆抗体IgG（二抗，武汉博士德公司）； SABC-FITC免疫荧光试剂盒（武汉博士德公司）；SABC即用型免疫组化试剂盒（美国 Sigma公司）。　　1.2  方法　　1.2.1  MSCs接种 　　无菌条件下将2.0 cm×2.0 cm大小的羊膜按上皮面朝上铺于6孔培养板中，取人MSCs细胞，接种于铺好的羊膜表面中，培养4 d后移植到实验兔角膜基质表面。　　1.2.2  动物模型的制作及MSCs和羊膜移植术 　　20只白兔随机分为实验组和对照组，每组10只，右眼为实验眼。实验兔于全麻下常规洗眼，消毒铺巾，开睑器开睑，用剃须刀环行去除深度约100～150 ?滋m，宽度约4 mm角巩膜缘组织，并刮除全部表层角膜上皮细胞，尽量保持基底面光滑。　　实验组：培养有MSCs的羊膜移植。将培养有人MSCs 4 d的羊膜以上皮面向下，覆盖到兔角膜缘干细胞缺损的动物模型的角膜基质层表面；10-0缝线环形作间断缝合，将羊膜固定于巩膜浅层，然后将球结膜缝回至羊膜边缘。　　对照组：单纯羊膜移植。将羊膜移植到兔角膜缘干细胞缺损的动物模型的角膜基质表面，手术方法同实验组。　　1.2.3  动物处死、取材和切片制备 　　术后动物继续常规饲养，用裂隙灯显微镜观察，局部和全身均未给予任何药物，分别于术后第1、第2、第3、第4和第6周处死动物，每次2只，将兔眼在4%多聚甲醛溶液中固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，沿眼球前后径做连续切片，厚度为6 μm，置于经多聚赖氨酸处理的载玻片上备用。　　1.2.4  组织病理学观察 　　分别对移植术后第1、第2、第3、第4和第6周制备的切片脱蜡至水，常规HE(苏木精、伊红)和PAS染色(示糖原)，用光镜观察。　　1.2.5  间接免疫荧光细胞化学染色 　　分别对移植术后第1、第2、第3、第4和第6周制备的切片脱蜡至水；新鲜配制的3% H2O2室温处理；0.5% Triton X-100打孔； 按照试剂盒的通用方法依次滴加正常血清封闭液、一抗AE1（阴性对照加入PBS）、FITC标记的羊抗鼠单克隆抗体IgG、SABC-FITC，甘油封片。用荧光显微镜观察并摄像记录。　　1.2.6  免疫组化法检测PCNA的表达 　　分别对移植术后第1、第2、第3、第4和第6周制备的切片脱蜡至水；新鲜配制的3%H2O2室温处理；0.5% Triton X-100打孔；按照试剂盒的通用方法依次滴加正常血清封闭液、一抗PCNA（阴性对照加入PBS）、羊抗鼠单克隆抗体IgG、SABC；DAB显色，蒸馏水洗涤；苏木素复染；脱水，透明，封片。用光镜观察并摄像记录。　　1.2.7  超微结构的观察 　　在移植术后第1、第2、第3、第4和第6周，分别制备扫描电镜标本和透射电镜标本，观察实验兔角膜表面细胞的超微结构。2  结果　　2.1  人MSCs在人羊膜上的分化情况 　　人MSCs接种在羊膜的上皮面后很快贴附生长，细胞呈梭形，胞核大，细胞活力好，48 h后融合成单层，第4天可见人MSCs在羊膜的基质面密集生长（见图1）。经免疫组化检测和流式细胞仪结果显示，羊膜上MSCs的表面标志与未接种于羊膜上的MSCs细胞一致。　　2.2  羊膜负载人MSCs移植到兔角膜缘干细胞缺损动物模型后的观察  　　羊膜平贴角膜表面，无感染迹象，第12天左右，两组羊膜开始出现部分融解，由中央部开始，第28天后角膜上皮愈合，基本透明，浅层角膜可见轻度混浊，角膜周边有新生血管长进，实验组角膜比对照组透明。　　2.3  临床观察和组织学检查 　　实验组角膜基质无水肿增厚，上皮层生长至第2周时已开始形成复层，第6周时已接近正常角膜上皮层厚度(见图2)；对照组上皮层不够光滑、平整，易脱落。实验组兔角膜PAS染色为阴性（见图3），而对照组为阳性（见图4)。　　2.4  免疫组织化学检查 　　在移植术后第4周，行免疫荧光细胞化学染色检查，在实验组中可见AE1染色阳性的角膜表层细胞（见图5)；并且在人MSCs移植术后第6周，免疫组化法在实验组中可见PCNA表达阳性的角膜表层细胞（见图6)。而对照组均为阴性。　　2.5  超微结构的观察 　　在移植术后第6周的实验组中，透射电镜可见细胞器丰富，细胞核呈圆形或椭圆形，体积较大，核周围有大量的张力丝，细胞间有桥粒连接（见图7）；扫描电镜可见细胞呈扁平不规则形状，表面有微绒毛和突起（见图8）。而对照组电镜观察未见以上明显的角膜上皮样细胞特征。3  讨论　　近年来，干细胞研究迅猛发展，为组织再生的基础研究与临床治疗带来了长足的进展。其中骨髓间充质干细胞（MSCs）取材方便，易于分离纯化，体外培养可以多次传代并保持分化能力，具有免疫赦免的特性和多胚层分化潜能，具有特殊的优势[4]，有望应用于多种疾病的临床治疗[5]。最近，国外研究人员通过骨髓移植实验发现MSCs在体内可分化为表皮细胞[2，6]；国内方利君等研究表明：MSCs在体外可诱导分化为上皮细胞，在体内皮肤微环境下也具有分化为表皮细胞的潜能[7-8]。但是MSCs分化为不同类型细胞的机制目前仍不清楚，目前大多数学者认为其分化方向与其周围的微环境密切相关。　　本研究将人MSCs接种到羊膜上培养4 d后，经免疫组化和流式细胞仪检测人MSCs表面标志未发生改变，说明羊膜对 MSCs无明显诱导分化作用，可作为MSCs移植的良好载体。临床观察和组织学检查的结果表明，人MSCs在兔角膜缘干细胞缺损的动物模型中发挥类似角膜缘干细胞的功能，使角膜缘干细胞缺损的动物模型角膜上皮化，阻止角膜结膜化（PAS染色阴性）。　　单克隆抗体AE1对角膜上皮中相对分子质量为48000的角蛋白具有高亲和力[9]，本研究AE1免疫荧光反应胞浆染色阳性较强，提示兔角膜缘干细胞缺损的动物模型的角膜表层细胞具有角膜上皮细胞特性。单克隆抗体PCNA是一种核内蛋白，在细胞周期中，PCNA于G1期开始积聚，S期达最大量，G2/M期减少，在正常组织中，PCNA阳性细胞仅局限于有增殖能力的区域[10]。本研究采用Anti-PCNA单克隆抗体对经人MSCs治疗的兔角膜缘干细胞缺损的动物模型的角膜表层细胞进行免疫荧光染色，结果证明大量细胞核呈阳性，提示此时大部分细胞具有高增殖能力。　　电镜下观察经人MSCs移植治疗的兔角膜缘干细胞缺损的动物模型的角膜表层细胞体积较小，核染色深，核仁明显增大，核附近张力丝丰富，细胞表面可见微绒毛，细胞间可见桥粒连接[11-12]。本实验扫描电镜可见细胞呈扁平不规则形状，表面有微绒毛和突起。透射电镜可见细胞器丰富，细胞核呈圆形或椭圆形，体积较大，核周围有大量的张力丝，细胞间有桥粒连接。以上表明，从超微结构上看，经人MSCs治疗的兔角膜缘干细胞缺损的动物模型的角膜表层细胞符合角膜上皮细胞的特性。　　本研究采用人MSCs移植到兔角膜基质，属于异种移植，但人MSCs和角膜处于免疫学上相对的赦免地位[4]，故人MSCs移植到兔角膜基质后短期内能存活。本实验仅观察MSCs在移植后6周内能存活和增殖，其长期的转归有待于进一步的观察研究。　　综上所述，人MSCs在兔角膜缘干细胞缺损的动物模型中能够被诱导分化为角膜上皮细胞，从而实现将 MSCs作为角膜上皮细胞种子细胞这一目标，这有待于进一步的深入研究。【参考文献】　　[1] Pittenger MF， Mackay AM， Beck SC， et al. 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