壳聚糖胶原复合膜在兔角膜基质层间的组织相容性

壳聚糖胶原复合膜在兔角膜基质层间的组织相容性作者：周晓伟，李国星，朱显丰，陈浩    作者单位：1.温州医学院附属眼视光医院，浙江 温州 325027；2.温州市生物材料工程技术研究中心，浙江 温州 325027   【摘要】  目的 探讨壳聚糖胶原复合膜植入兔角膜基质层的组织相容性，以评价其作为人组织工程角膜修复支架材料的可行性。方法 选用8只新西兰白兔，根据角膜基质层间植入膜片材料的不同平均分为A、B两组，A组植入壳聚糖胶原复合膜（实验组）、B组植入壳聚糖膜（对照组）。术后观察并记录术眼球结膜充血、角膜水肿、前房闪辉、角膜新生血管、材料的变化等情况，术后第8周取术眼角膜组织制作病理学切片进行HE染色观察，比较两组材料对角膜组织的不同影响。结果 术后8周内，实验组炎症反应轻于对照组，且无角膜新生血管发生，对照组有2例发生角膜新生血管，两组膜片均于术后第2周开始降解，但在相同观察时间点，实验组膜片降解程度小于对照组。HE染色显示实验组膜片周围炎性细胞浸润轻于对照组，膜片降解程度小于对照组，降解物与角膜基质纤维融合。结论 壳聚糖胶原复合膜与活体兔角膜基质组织的相容性比壳聚糖膜更优，其作为角膜损伤修复材料具有广阔前景。   【关键词】  壳聚糖；壳聚糖胶原复合膜；组织工程角膜；组织相容性   Study on histocompatibility of rabbit cornea with complexes of collage-chitosan membrane ZHOU Xiaowei， LI Guoxing， ZHU Xianfeng， et al.　Hospital of Optometry & Ophthalmology， Wenzhou Medical College， Wenzhou China， 325027　［Abstract］Objective  To study the histocompatibility of collagen-chitosan membrane with the cornea after implanted into the corneal stroma of rabbits and evaluate the feasibility of using the polymer as cornea repair material. Methods  Eight New Zealand rabbits were divided equally into group A (experimental group， EG) and group B (control group， CG) according to the different implanted membranes， group A with collagen-chitosan membrane and group B with chitosan membrane. Conjunctival congestion， corneal edema， aqueous flare， corneal neovascularization and changes of membranes were observed and recorded clinically. The cornea samples were taken at the 8th week after surgery for histological examination. Results  All the eyes implanted with membranes were steady except for slight inflammatory reaction during the first postoperative week. The inflammatory reaction of  the corneas in group A was less than that in group B. Two animals were found cornea neovascularized in group B while none in group A during the observation period. The degradation of the implanted membranes began at the second week after implantation in both groups， but the rate of degradation in group A was slower than that in group B at the same observation point. According to the histological observation， the degree of the inflammatory reaction surrounding corneal stroma and the degradation of the implanted membranes in group A were lighter than that in group B. The corneal collagen fibers were mixed with the patches of the degradation products of membranes in both groups. Conclusion  Collagen-chitosan membrane has a relatively better histocompatibility with the corneal stroma than chitosan and will potentially be used as the scaffold of tissue-engineered cornea. 　［Key words］chitosan； collagen-chitosan membrane； tissue engineered cornea； histocompatibility    角膜疾患是眼科常见病、多发病，是主要致盲眼病之一。绝大多数角膜病致盲患者可以通过角膜移植重见光明，但我国角膜供体十分匮乏，限制了角膜病的治疗，因此寻找合适的角膜替代物的要求变得十分迫切[1]。合适的组织工程角膜支架首先必须具有适中的生物降解速度，良好的组织相容性、细胞亲和力、力学性能，特定的三维孔结构，容易灭菌消毒[2]等特性。本研究采用壳聚糖胶原复合物、壳聚糖膜片植入兔角膜基质层间，旨在观察比较其活体组织相容性，以期寻找合适的组织工程角膜修复材料。1  材料和方法　　1.1  主要的仪器与材料 　　仪器包括手术显微镜（YZ20T6，苏州医疗器械总厂），裂隙灯显微镜（Haag-Streit 900型，瑞士），生物显微镜（OLYMPUS B×41，日本），眼科切片机（Leica RM2135，德国）。材料包括壳聚糖(上海伯奥公司)：脱乙酰度≥90.0%，黏度＜0.1 % Pa.s；甲基丙烯酸羟乙酯（Sigma，USA），硝酸铈铵（上海帝阳化工有限公司）；Ⅰ型活性胶原蛋白溶液(广州创尔生物技术有限公司)，含量为5.0 g/L；冰醋酸：AR(天津市化学试剂一厂)；氢氧化钠：AR(天津市大茂化学试剂厂)。　　1.2  壳聚糖及其胶原复合膜的制备　　1.2.1  壳聚糖膜的制备　　将壳聚糖溶于质量分数为2%的乙酸溶液中，充分搅拌后，除去气泡，置于模具中自然风干成膜，然后用5%的NaOH溶液浸泡30 min，再用去离子水反复冲洗，浸泡24 h，干燥备用，膜厚约为20 μm，用角膜环钻裁制成直径4 mm的膜片，环氧乙烷灭菌。术前30 min用0.9 %生理盐水浸泡，复水，紫外线照射灭菌后备用。　　1.2.2  壳聚糖胶原复合膜的制备 　　将壳聚糖溶于  1%的乙酸溶液中，配制成 10 g/L的壳聚糖-乙酸溶液，与胶原溶液混合，制成胶原含量为30%的混合液，充分搅拌后，除去气泡，置于模具中自然风干成膜，余下步骤同壳聚糖膜的制备。　　1.3  动物模型的制作　　1.3.1  实验动物及分组 　　选取健康新西兰大白兔（上海生旺实验动物养殖有限公司，许可证编号SCXK(2007-0007)）8只，4周龄，雌雄不限，体重平均2.0 kg左右，眼前段正常。根据角膜基质层间植入材料的不同共分A、B两组，每组4只，均选取右眼植入，A组（实验组）植入壳聚糖胶原复合膜，B组（对照组）植入壳聚糖膜。　　1.3.2  材料植入方法及步骤　　术前再次检查动物的基本情况并称体重，采用氯胺酮（35 mg/kg）和甲苯噻嗪（5 mg/kg）混合麻醉药行肌肉注射麻醉动物。用碘伏消毒内眼及眼睑部，丁卡因点眼局部麻醉，用开睑器开睑，严格按照无菌显微手术操作的步骤。选取兔右眼，鼻下方切口，使用隧道刀、虹膜恢复器在1/2角膜厚度处分离出约4 mm×4 mm板层囊袋，将膜片植入囊袋内，10-0尼龙缝线缝合切口，涂氧氟沙星眼膏。　　1.3.3  术后用药　　局部应用左氧氟沙星滴眼液、妥布霉素地塞米松滴眼液，每日3次，每次1滴；每晚用氧氟沙星眼膏涂眼，连续7 d，然后逐渐减量至停药。　　1.4 　裂隙灯观察 　　术后第1天、第4天、第1周及以后每周的相同时间点都由同一观察者，通过裂隙灯显微镜检查术眼角膜情况，观察并记录实验动物术眼结膜充血、角膜水肿、前房闪辉、角膜新生血管及植片变化等情况。　　1.5  组织病理学观察 　　术后第8周处死动物，取角膜，以包含植入材料的断面为切片面，在磷酸盐缓冲液(PBS液)中清洗后，投入切片固定液中固定5 h，用石蜡包埋标本放入65 ℃的干燥箱内3 h烘干，制作切片，苏木素-伊红（HE）染色，在生物显微镜下进行观察。2  结果　　2.1  裂隙灯显微镜观察结果 　　术后第1天，两组动物均有球结膜充血、前房闪辉。术后第4天，两组球结膜充血减轻，前房闪辉减少。术后第1周，球结膜充血和前房闪辉消失。术后第2周，植入膜片周边出现白色降解点状浸润(见图1、图2)，随观察时间延长，范围逐渐扩大并向植片中心进展(见图3、图4)。术后第8周，A组膜片中央出现降解浸润，皱褶屈曲不明显（见图5）；B组膜片全部浸润，其明显皱褶屈曲（见图6），在各观察时间点，A组降解浸润程度小于B组。术后第6周，两组各有1例角膜上皮缺损（见图7、图8）。术后8周内，A组未见角膜新生血管发生，B组有2例发生角膜新生血管，但范围未及角膜1/3，且未接近植片周围（见图8、图9）。　　2.2  切片染色结果 　　术后第8周，A组膜片表层少量降解，降解物质与角膜基质融合，材料边界易辨认，膜片周围角膜基质少量炎性细胞浸润，角膜基质纤维排列有序(见图10、图11)；B组膜片表层降解程度大于A组，膜片结构疏松，膜片周围角膜基质有较多炎性细胞浸润，多为中性粒细胞，降解材料与角膜基质交织融合(见图12、图13)。3  讨论　　在组织工程支架材料方面，羊膜作为组织工程化角膜上皮细胞的载体， 已经应用于临床治疗眼表疾病并取得了一定的成效[3]。但羊膜有一定的局限性，如羊膜组织较薄，不是完整均匀的全透明组织，并且可能携带病原体[4]。因此，我们亟待寻找一种性能更优的替代物。　　壳聚糖是一种新型的生物工程材料，生物学特性优良，具有较好的组织相容性和生物可降解性，无毒、无刺激、无抗原性，可促进生长因子的合成，可以作为生长因子释放的载体，具有抑制纤维细胞生长、促进上皮细胞分化的作用，已广泛应用于医学科学的各个领域[5]。　　壳聚糖与胶原复合，由于壳聚糖带正电荷而胶原带负电荷，两者除了以氨基和羟基结合外，还以静电引力相结合，增加了其稳定性，弥补了壳聚糖强度不高的缺陷，增加了胶原的组织相容性[6]。Zhu等[7]研究了脂肪组织源性干细胞在壳聚糖胶原复合物支架上的增生情况，结果显示其黏附性、扩增性以及生物活性均较好，有望成为一种性能更加良好的角膜组织工程支架。　　本实验将壳聚糖胶原复合膜和壳聚糖膜分别植入兔角膜基质层间，术后两组均有炎症反应发生，组织学切片显示，实验组炎症程度小于对照组，可见角膜对复合膜的适应性更加良好。角膜新生血管的发生会破坏角膜的免疫赦免状态，是导致角膜移植术后免疫排斥反应的高危因素[8]。角膜营养通路的切断、角膜缺氧、炎性细胞的浸润等均可导致新生血管的生长[9]。本研究中，实验组在术后8周内均未发现角膜新生血管，而对照组发生2例角膜新生血管，可见复合膜的组织相容性相对要优于壳聚糖膜，不易诱发新生血管。角膜上皮缺损多因角膜营养通路的部分阻断，导致上皮营养供给不足，同时上皮基底膜结构的破坏，引起层黏连蛋白减少，致上皮细胞疏松、无法附着而引起[10]。两组各出现1例角膜上皮点状缺损，但实验组的缺损程度轻于对照组，可见其对于角膜局部代谢的影响相对要小。膜片降解开始后的各时间点，复合膜降解程度小于壳聚糖膜，这在后期得到组织学检查的证实。总之，壳聚糖胶原复合膜比壳聚糖膜炎症反应轻，对角膜的局部影响小，不易诱发新生血管，呈现出较好的活体组织相容性。　　有关壳聚糖膜方面，丁勇等[11]将大小5 mm×4 mm，厚度约0.5 mm 壳聚糖材料植入兔眼角膜囊袋内，术后第1周即有角膜新生血管，术后第4周新生血管长入植入的材料周围，术后第8周自然消退。本实验中，采用大小4 mm×4 mm，厚度约0.02 mm 壳聚糖膜，术后第6周始发生角膜新生血管，范围仅在角巩缘处周边且未接近植片周围，相比起丁勇的研究，新生血管生长时间延迟，范围较小。分析认为：采取相同材料、厚度不同的材料植入时，对角膜局部营养通路的影响作用受厚度的影响，厚度越大，对角膜局部环境影响越大，新生血管长入的危险性也随之增大。本实验中，壳聚糖膜组角膜新生血管尚未自然消退，推测可能与观察时间太短有关。近年来，角膜修复的组织工程材料的另一个研究热点是用异种脱细胞角膜基质植入活体动物角膜，多在术后第2周左右有角膜新生血管长入，引起排斥反应，同时，异种角膜基质仍可能会引入抗原成分，导致严重的炎症反应[12]。本研究中采用壳聚糖胶原复合膜植入兔角膜基质，炎症反应轻微，在观察时间内无新生血管长入角膜，具有良好的组织相容性，而且获取途径相对简单，制备技术容易掌握，其应用前景更加广阔，但是植入后的长期组织相容性以及材料降解行为仍需进一步研究探索。【参考文献】　　[1] Narayan R. 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