豚鼠近视眼视网膜Müller细胞近视因子基因的表达

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞近视因子基因的表达作者：毛俊峰，刘双珍，秦文娟，吴小影，李凤云，夏朝华    作者单位：中南大学湘雅医院 眼科，湖南 长沙 410008    【摘要】  目的 研究视网膜近视因子基因在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的表达变化。方法 3～4周龄断乳三色豚鼠40只，取20只建立近视眼模型（以右眼作为实验眼，以对侧未遮盖眼作自身对照），剩余的20只豚鼠作正常对照。用眼罩遮盖法建立豚鼠近视眼模型，用酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞。RT-PCR检测酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、神经型一氧化氮合成酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、视黄醛脱氢酶（retinaldehyde dehydrogenase，RALDH）、醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、转化生长因子β（transforming growth factor－β，TGF-β）的mRNA在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况。数据分析采用One-way ANOVA检验。结果 眼罩遮盖10 d后，遮盖眼眼轴延长，近视形成。酶消化法成功培养出视网膜Müller细胞。正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达nNOS、bFGF、TH、TGF-β mRNA，且遮盖眼表达nNOS、bFGF和TGF-β mRNA上调(P<0.05)，TH mRNA下调(P<0.05)。iNOS mRNA仅在遮盖眼视网膜Müller细胞阳性表达。三组视网膜Müller细胞均不表达eNOS、RALDH和ALDH mRNA。结论 豚鼠近视眼视网膜Müller细胞表达nNOS、 iNOS、bFGF和TGF-β mRNA上调，TH mRNA下调。Müller细胞是近视眼视网膜信号因子一氧化氮（nitric oxide，NO）、多巴胺（dopamine，DA）、bFGF和TGF-β的一个重要来源。    【关键词】  Müller细胞；视网膜；信号因子；近视；豚鼠    Gene expression of the myopic factors in retinal Müller cells of the guinea pig myopic eye　MAO Junfeng， LIU Shuangzhen， QIN Wenjuan， et al.Department of Ophthalmology， Xiangya Hospital of Central South University， Changsha China， 410008　　［Abstract］  Objective  To investigate the gene expression of retinal myopic factors in the Müller cells in a primary culture of the guinea pig myopic eye. Methods  Guinea pig myopia was induced by translucent goggles， from which retinal Müller cells were cultured using the enzyme-digesting method. The mRNA expression of tyrosine hydroxylase (TH)， inducible nitric oxide synthase (iNOS)， neuronal nitric oxide synthase (nNOS)， endothelial nitric oxide synthase (eNOS)， retinaldehyde dehydrogenase (RALDH)， aldehyde dehydrogenase (ALDH)， basic fibroblast growth factor (bFGF) and transforming growth factor－β (TGFβ) were analyzed by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) in the guinea pig retinal Müller cells. All data were analyzed by a one-way ANOVA test. Results  After 10 days of deprivation， the occluded eyes became myopic with an elongated axis. Retinal Müller cells were obtained from the guinea pigs using enzyme digestion. nNOS， bFGF， TH and TGF-β mRNA were positively expressed in the retinal Müller cells of the normal control eyes， the self-control eyes and the occluded eyes. An increase in nNOS， bFGF and TGF-β mRNA was found in the occluded eyes (P<0.05)， with a decrease in TH mRNA (P<0.05). Retinal Müller cells only showed positive expression of iNOS mRNA in the occluded eyes. eNOS， RALDH and ALDH mRNA were negatively expressed in the retinal Müller cells. Conclusion  An upregulated expression of nNOS， iNOS， bFGF and TGFβ mRNA and a down regulated expression of TH mRNA were found in retinal Müller cells of the guinea pig myopic eyes. It has been shown that Müller cells are an important source of retinal signal factors， such as NO， DA， bFGF and TGF-β， in myopic eyes.　　［Key words］Müller cell； retina； signal factor； myopia； guinea pig　　目前已证实,近视眼的形成和发展是在视网膜调控下巩膜主动重塑的结果[1]，参与视网膜调控的信号因子主要有多巴胺（dopamine，DA）[2]、一氧化氮（nitric oxide，NO）[3]、视黄酸（retinoic acid，RA）[4]、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）[5-6]、转化生长因子β（transforming growth factor－β，TGF-β）[5]。Müller细胞是视网膜最主要的神经胶质细胞，与视网膜三级神经元共同构成“神经元－神经胶质”调控网络，参与视网膜的生理、病理过程。因此，我们建立豚鼠近视眼模型，原代培养其视网膜Müller细胞，研究酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）——DA合成酶、诱导型NO合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、神经型NO合成酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、内皮型NO合成酶（endothelial nitric oxide synthase， eNOS）、视黄醛脱氢酶（retinaldehyde dehydrogenase， RALDH）——RA合成酶、醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）——RA合成酶、bFGF和TGF-β基因在近视眼视网膜Müller细胞中的表达变化。1  材料和方法　　1.1  豚鼠近视眼模型制作  　　3～4周龄断乳三色豚鼠40只（中南大学动物部提供），体重200～220 g，雌雄不限。取20只建立近视眼模型，用自制半透明眼罩（材料为乳白色乳胶手套）遮盖右眼，缝3～4针固定于眼眶周围组织，具体方法参见文献[7-8]。以对侧未遮盖眼作自身对照，剩余的20只豚鼠作正常对照。遮盖10 d后，用0.5％托吡卡胺扩瞳验光测眼球屈光度，用A型超声测量眼轴长度，测3次，取平均值。　　1.2  豚鼠视网膜Müller细胞的原代培养 　　具体培养方法参见文献[8]。腹腔注射0.3％戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，75％酒精浸泡消毒5 min。摘眼球，分离出神经视网膜，将其移入完全培养液，剪碎，用0.25%胰蛋白酶消化10 min，吸管吹打，制成细胞悬液，于37℃、5％ CO2的自动培养箱内培养。24 h后首次换液，以后每3~4天换液1次，待细胞汇合成片、贴壁细胞达80％以上时按1∶2传代。　　1.3  RT-PCR检测近视因子mRNA表达 　　取第2代Müller细胞，PBS洗涤，用细胞刮子将其刮下，吸至1.5 ml离心管内，按照Trizol RNA提取试剂盒（美国Gibco BRL公司）说明书操作，提取Müller细胞总RNA。用甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性，DU-640紫外分光光度计测定RNA的浓度。按照ReverTra Ace-α-TM First Strand cDNA合成试剂盒（日本Toyobo公司）说明书进行操作，合成cDNA。根据Genebank中的基因序列，以Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。按照TaKaRa LA PCR Kit Ver.2.1（日本TaKaRa公司）说明书建立20 μl反应体系，PCR反应条件：变性T1 95℃ 5 min，T2 94℃ 30 s；退火53℃（iNOS，eNOS）、55℃（TH，RALDH，ALDH，bFGF）、56℃（nNOS，TGF-β） 30 s；延伸72℃ 30 s；共35个循环，再延伸72℃ 5 min（PCR引物见表1）。取PCR产物10 μl，1.5％琼脂糖凝胶电泳60 min（电压80 V）。以G3PDH（450 bp）或β-actin（200 bp）为内参。Gelpro 4凝胶光密度分析软件测量目的条带的积分光密度（IOD）值，计算目的条带mRNA相对表达量（目的条带mRNA相对表达量＝目的条带IOD值/内参条带IOD值）。　　1.4  统计学方法 　　所有数据用x±s表示，用SPSS 11.0统计软件包进行处理。豚鼠眼屈光度、眼轴长度及视网膜Müller细胞近视因子mRNA相对表达量的比较均采用One-way ANOVA检验。P<0.05表示差异有统计学意义。2  结果　　2.1  豚鼠近视眼模型 　　眼罩遮盖10 d后，豚鼠遮盖眼眼轴延长，近视形成。其屈光度与自身对照眼、正常对照眼相比，差异有统计学意义（P<0.05）；遮盖眼眼轴长度为（8.42±0.14）mm，与自身对照眼、正常对照眼相比，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。　　2.2  视网膜Müller细胞近视因子mRNA表达变化　　甲醛变性凝胶电泳显示：正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞的总RNA电泳均有28S、18S和5S条带，且28S和18S条带清晰、无弥散，28S条带的亮度约是18S的2倍，表明所提取的RNA完整（见图1）。正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞RNA的OD260/280为1.93、1.89、1.91，证明所提取的RNA无污染。　　RT-PCR检测显示：正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼的视网膜Müller细胞均阳性表达nNOS、bFGF、TH、TGF-β的mRNA，且nNOS、bFGF和TGF-β mRNA在遮盖眼表达上调，TH mRNA在遮盖眼表达下调，分别与正常对照眼、自身对照眼比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；iNOS mRNA在正常对照眼和自身对照眼视网膜Müller细胞中均不表达，但阳性表达于遮盖眼；正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼的视网膜Müller细胞均未检测到eNOS、RALDH和ALDH的mRNA（见表3、图2）。3  讨论　　Müller细胞是视网膜内最主要的神经胶质细胞，呈细长形，自外界膜纵向伸展至内界膜，胞体位于内核层。其胞体向近端伸展的突起终止视网膜内界膜毗邻玻璃体；顶突起向远端伸展，终止于光感受器层；胞体主干伸出许多侧突，穿行于神经元之间并附着于神经元胞体或树突，包绕视锥细胞、视杆细胞、双极细胞、水平细胞、神经节细胞等。从其解剖特点可看出，Müller细胞及其突起广泛分布于视网膜各类神经元胞体和纤维之间，使之能够与视网膜三级神经元构成“神经元－神经胶质”调控网络，在视网膜的功能活动中发挥重要作用，包括支持和营养神经元，维持细胞外离子稳定，参与谷氨酸循环及突触传递，感受神经元信号和调节神经元活动等[9]。但是，目前尚不明确视网膜Müller细胞与近视眼发生的关系。近视眼发病机制的研究是眼科领域的研究热点之一，目前已公认近视眼的发生是在视网膜调控下巩膜主动重塑的结果。近视眼动物模型主要有两类：形觉剥夺性近视眼和光学离焦性近视眼。在眼罩遮盖、眼睑缝合或戴凹透镜后，视网膜感受外界视觉环境的变化，并产生近视信号因子，作用于视网膜色素上皮和脉络膜，使之产生下一级信号因子，进而调控巩膜的生长代谢，导致眼轴延长，形成近视眼[1]。大量研究证实，视网膜对近视眼发生的调控，与其合成、分泌一些信号因子（如DA、NO、RA、bFGF、TGF-β等）密切相关。近视眼发生过程中，视网膜NO、RA、TGF-β和夜间bFGF的含量升高[3-6]，而DA含量下降[2]，这些信号因子共同构成近视眼的视网膜神经调控网络，影响着近视眼的发生、发展。视网膜的细胞成分比较复杂，包括光感受器细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、神经节细胞、Müller细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞等，目前尚不清楚究竟是哪些细胞通过分泌这些近视信号因子，参与近视眼的发生、发展。　　许多研究发现，视网膜Müller细胞能合成、分泌多种神经活性物质及信号因子。Kubrusly等[10]报道了视网膜Müller细胞能表达DA受体和TH，参与视网膜DA代谢。视网膜Müller细胞还能合成bFGF[11]、TGF-β[12]、NO[13]、nNOS[14]和iNOS[13-14]。本研究中，我们原代培养豚鼠正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞，采用RT-PCR检测TH、  iNOS、nNOS、eNOS、RALDH、ALDH、bFGF和TGF-β的mRNA表达变化，研究视网膜Müller细胞与近视信号因子基因表达的关系。结果显示，对照眼和近视眼视网膜Müller细胞均表达TH、nNOS、bFGF和TGF-β的mRNA，且TH mRNA在近视眼表达下调，nNOS、bFGF和TGF-β mRNA在近视眼中表达上调；iNOS mRNA仅在近视眼视网膜Müller细胞中表达；豚鼠视网膜Müller细胞不表达eNOS、RALDH和ALDH mRNA。众所周知，TH是DA的合成酶，iNOS、nNOS和eNOS是NO的合成酶，RALDH和ALDH是RA的合成酶。由于nNOS、iNOS、TH、bFGF和TGF-β mRNA在豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的表达变化，与近视眼发生过程中视网膜NO、DA、bFGF和TGF-β的变化趋势是一致的，因此Müller细胞是豚鼠近视眼视网膜信号因子NO、DA、bFGF和TGF-β的一个重要来源，在近视眼发生过程中Müller细胞可能通过合成、分泌这些近视信号因子，参与近视眼的视网膜神经调控网络。在豚鼠视网膜Müller细胞中未检测到RALDH和ALDH 的mRNA，表明豚鼠视网膜Müller细胞可能不能合成RA或两者在Müller细胞中的表达量低于RT－PCR的检测水平，因此近视眼视网膜RA的表达上调可能主要来源于其他的视网膜细胞。　　总之，nNOS、iNOS、TH、bFGF和TGF-β mRNA在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中表达上调，TH mRNA表达下调。在豚鼠近视眼发生过程中，Müller细胞是视网膜信号因子NO、DA、bFGF和TGF-β的一个重要来源， Müller细胞可能通过合成、分泌这些近视信号因子，调控近视眼的发生、发展。【参考文献】　　[1] McBrien NA， Gentle A. 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