兔蒸发过强型干眼白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和黏附分子1的表达

兔蒸发过强型干眼白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和黏附分子1的表达作者：庞润晖，宋秀君    作者单位：1.河北省邢台市眼科医院，河北 邢台 054001；2.河北省第三医院 眼科，河北 石家庄 050051    【摘要】  目的 探讨炎性细胞因子在蒸发过强型干眼的发病机制中所起的作用。方法 20只新西兰大白兔被随机分为实验组和对照组两组，实验组烧灼兔睑板腺开口制成蒸发过强型干眼模型，对照组不作处理。第1、第6、第11周用放射免疫法及酶联免疫法测泪液中白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量，第11周时处死兔，用免疫组化方法检测细胞间黏附因子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)在角膜、结膜组织中的表达。结果 实验组兔Schirmer Ⅰ滤纸湿长、泪膜破裂时间均较正常组增加（P<0.01）；实验组泪液中IL-6、TNF-α的含量均较对照组增高(P<0.01)；ICAM-1在两组兔角膜、结膜组织上皮均有表达，阳性反应物呈棕黄色，主要表达于细胞浆。在实验组表达较强，在对照组表达较弱，两者差异有非常显著的统计学意义（P<0.01）。每1000个细胞中阳性细胞表达数在实验组(角膜为272.1±46.8，结膜为302.7±56.3)明显高于对照组(角膜为50.2±5.9，结膜为60.4±15.3)(P<0.01)。结论 细胞因子在蒸发过强型干眼的发病机制中起着重要的作用，蒸发过强型干眼的发病机制与炎症有关。     【关键词】  干眼，蒸发过强型；细胞因子；免疫反应     Experimental study of the expression of interleukin-6， tumor necrosis factor-α and intercellular adhesion molecular-1 on evaporative dry eye in the rabbit PANG Runhui*， SONG Xiujun. Hebei Xingtai Eye Hospital， Xingtai China， 054001    ［Abstract］  Objective  To investigate the role of inflammatory cytokine in evaporative dry eye. Methods  Twenty rabbits were randomly divided into an experimental group and a control group. A dry eye model was established by cauterizing the meibomian gland orifices of rabbits in the experimental group.  ELISA and radioimmunity were used to detect the concentrations of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) in tears at 1， 6， and 11 weeks after cauterizing the meibomian gland. The rabbits were sacrificed 11 weeks after cauterizing the meibomian gland. Their corneal and conjunctival epithelia were examined by immunohistochemical staining to detect the expression of intercellular adhesion molecular-1 (ICAM-1). Results  Schirmer Ⅰ test wetting in the experimental group (5.1±1.6)mm was significantly shorter than that of the control group (18.6±4.2)mm at 6 weeks after cauterizing (P<0.01). BUT time in the experimental group (3.4±1.1)s was shorter than that of the control group (17.6±3.4)s (P<0.01). The concentration of IL-6 in tears was higher in the experimental group (434.4±38.7)pg/ml than in the control group (150.1±23.6)pg/ml (P<0.01). The concentration of TNF-α in tears was higher in the experimental group (7.63±0.40)pg/ml than in the control group (3.53±0.54)pg/ml (P<0.01). ICAM-1 expression in positive cells of 1000 cells in the corneal and conjunctival epithelia in the experimental group (272.1±46.8， 302.7±56.3， respectively) was stronger than that of the control group (50.2±5.9， 60.4±15.3， respectively) (P<0.01). Conclusion  Cytokines play an important role in the pathogenesis of evaporative dry eye.    ［Key words］  evaporative dry eye； cytokine； immunereaction      近年来随着免疫学和分子生物学的研究进展，我们对干眼的病因有了更新的认识——细胞因子参与了免疫和炎症反应，在干眼的发病机制中起到了十分重要的作用。研究发现，泪液生成不足型干眼患者的结膜、泪腺活检标本内和泪液中均发现白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、细胞间黏附因子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)等含量和表达增加[1-3]，并与干眼的损害程度呈正相关。然而蒸发过强型干眼发病机制是否也有细胞因子参与还未得到证实。本研究通过检测细胞因子在蒸发过强型干眼中的变化来探讨细胞因子在其发病机制中所起的作用。1  材料和方法    1.1  主要试剂和仪器  IL-6放射免疫试剂盒（解放军总医院科技开发中心放免所）；鼠抗人细胞黏附因子多克隆抗体（北京中杉）；TNF-α ELISA试剂盒（美国TBE公司）；放射免疫测定仪（德国Brand公司）；酶标仪（法国Jouan公司）；真彩色病理图像分析系统（北京航空航天大学图像中心）。    1.2  方法    1.2.1  实验动物及分组  健康新西兰大白兔20只(河北医科大学第三医院实验动物中心提供)，雌雄不分，体重2~2.5 kg，将实验动物随机分为两组，第1组10只兔，为对照组，不作处理；第2组10只兔，为实验组，制成蒸发过强型干眼模型。    1.2.2  蒸发过强型干眼动物模型的制作  本实验在河北医科大学第三医院动物试验室进行，对环境的空气对流、湿度和温度都进行了统一标准的控制。空气对流情况：换气量为10~20次/h，气流速度≤0.18(M/S)，温度18℃~29℃，湿度40%~70%。实验组参照肖启国等[4]制作干眼模型的方法制成干眼模型。将兔耳缘静脉暴露，按0.1 g/kg体重进行氯胺酮静脉麻醉。麻醉满意后，在手术显微镜下用一次性烧灼器逐个烧灼双眼上下睑所有睑板腺开口，每一开口烧灼时间约1 s，术后结膜囊涂红霉素眼膏。术后第2天检查睑板腺开口情况，如有开放，给予补充烧灼。术后6周干眼模型形成。    1.2.3  诊断标准  两组动物均由同一人检查，每次检查时间、地点、照明亮度、湿度及温度相同，检测各组的Schirmer Ⅰ实验、泪膜破裂时间(tear break-up time，BUT)和虎红染色。SchirmerⅠ实验滤纸湿长 <10 mm/5 min 为异常，BUT<10 s为异常。虎红染色参照文献[5]标准。    1.2.4  收集兔泪液  兔泪液由同一人采集，在同一时间、同一地点、相同的温度和湿度条件下，分别取对照组和实验组第1、第6、第11周的泪液。在尽量减少人为刺激的条件下，用毛细玻璃管吸取结膜囊内的泪液，放入试管中，于-20℃中保存，以备用于检查泪液中IL-6、TNF-α的含量。    1.2.5  标本取材及处理  在第11周时，两组兔均以空气栓塞法处死，取双眼角膜、结膜组织，用免疫组化方法检测ICAM-1在角膜、结膜组织中的表达。    1.2.6  TNF-α浓度检测(ELISA法)  取出所需反应板，加入25 ?滋l标准品、25 ?滋l样品于相应孔中。加入25 ?滋l Biotin anti Rabbit TNF-α，轻轻混匀30 s，于室温温育30 min，每孔加入50 ?滋l HRP，轻轻混匀30 s，于室温温育30 min，每孔加入50 ?滋l显色液，轻轻混匀10 s，于室温温育15 min。每孔加入50 ?滋l终止液(Stop Solution)，轻轻混匀30 s，30 min内在450 nm处读OD值。根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。    1.2.7  IL-6检测方法(放射免疫测定法)  采用平衡法标记聚苯乙烯试管，分别为总数(T)、非特异结合(NSB)、最大结合(S0)和样本(U)。加样。室温放置20 min后，离心。设置γ计数仪各参数后，按放免程序要求将各测定管放入测定架上，按次序进行测定。测量结束，处理数据，打印出待测样品结果进行分析。    1.2.8  ICAM-1表达的测定（免疫组织化学染色，LSAB法)  经抑制内源性过氧化物酶及1%牛血清白蛋白(BSA)封闭，加鼠抗人ICAM-1多克隆抗体，置4℃湿盒中过夜；加生物素偶联马抗小鼠IgG二抗，37℃ 30 min；加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃ 40 min，0.05%DAB溶液显色，以PBS或BSA代替一抗做阴性对照。    1.3  统计学方法  使用SPSS12.0统计软件进行统计处理，采用两样本t检验和单因素方差分析。2  结果    2.1  在制作蒸发过强型兔干眼模型前后检测Schirmer Ⅰ、BUT、虎红染色的变化。到第6周时，成功制成干眼模型（见表1）。    2.2  术后第1、第6、第11周，两组兔泪液中IL-6、TNF-α含量对比，实验组的含量比对照组明显增高，经统计学处理显示，两组差异有非常显著的统计学意义(P<0.01)（见表2）。    2.3  ICAM-1在两组兔角膜、结膜组织上皮均有表达，阳性反应物呈棕黄色，主要表达于细胞浆。实验组ICAM-1的表达较对照组明显增加。经统计学处理显示，两组差异有非常显著的统计学意义(P<0.01)（见表3、图1~图4）。3  讨论    美国国立眼科研究所将干眼分为泪液生成不足型和蒸发过强型两种。泪液生成不足型干眼在临床上以干燥性角结膜炎(keratoconjuctivitis sicca，KCS)和Sj?觟gren综合征(Sj?觟gren Syndrome，SS)最为多见，蒸发过强型干眼则包括睑板腺功能障碍(meibomain gland dysfunction，MGD)、暴露及角膜接触镜等因素所致的干眼症。    MGD与睑板腺阻塞或分泌异常有关，是导致脂质性泪液缺乏或蒸发过强型干眼的主要原因之一[6]。关于细胞因子在引起干眼的发病机制中所起的作用，国外已有很多研究，但都是关于泪液生成不足型干眼的，而对于蒸发过强型干眼的发病机制却鲜见报道。    TNF-α是细胞黏附和趋化的主要递质，主要负责炎症期间细胞迁移的调控。1999年，Pflugfelder将SS患者结膜上皮TNF-α的表达与正常人对比发现，TNF-α的RNA转录产物在SS患者结膜上皮中明显增高[2]。2004年，Oshida等[7]采集33名SS患者泪液，用双夹心抗体酶联免疫吸附测定法检测干眼患者泪液中TNF-α的含量，并通过荧光素染色评分判断角膜上皮受损情况。结果显示干眼患者泪液中TNF-α浓度在8~1500 pg/ml之间，荧光素染色评分高的患者浓度高，这表明泪液中TNF-α含量与角膜上皮受损呈正相关。    IL-6是一种调节炎症反应的细胞因子，是T细胞和B细胞功能的重要调节因子，可刺激造血细胞的生长和分化。免疫病理结果显示，KCS和SS患者结膜上皮多种炎性因子增高，而IL-6是最有价值的[1]，在SS患者的唾液和血清中IL-6含量也增高[8]。    ICAM-1是最早发现的免疫球蛋白超家族黏附分子之一，IL-6、TNF-α、IFN-γ等细胞因子均可促进ICAM-1分子的表达。在SS患者的泪腺中发现 ICAM-1存在于腺泡上皮细胞、成纤维细胞和少量单核细胞上[9]。Gao等[3]采用免疫组化和原位杂交法检测ICAM-1在KCS患者和SS小鼠泪腺和结膜组织中的表达，发现其含量增加，ICAM-1在上皮细胞中合成是眼表易患炎症的标志。    睑板腺分泌睑脂构成泪膜的脂质层。1941年，VonBahr首次对兔角膜表层的泪液蒸发进行测量，发现去除脂质层后泪液蒸发率增加10～20倍，角膜明显变薄。由于脂质层异常造成的干眼症，共47%～78%的泪液可通过蒸发失去。临床上如患者睑板腺缺如而泪液生成正常，可使泪液蒸发率增加3倍，从而导致蒸发过强型干眼的发生。由于临床上干眼患者病因较复杂，包括很多类型， 如视频终端综合征和大楼办公室综合征等，很难观察到单纯由于睑板腺功能障碍导致的蒸发过强型干眼患者，因此本实验通过制作蒸发过强型干眼动物模型来检测细胞因子的含量，并推测其在发病机制中所起的作用。    为制成蒸发过强型干眼的动物模型，1989年，Glibard等[10]用纤细的电刀插入兔睑板腺开口逐个进行灼烙(每个开口灼烙时间约1 s)，导致睑板腺开口阻塞，睑板腺脂质不能正常排出，引起泪膜脂质层异常，从而产生干眼。肖启国等[4]对Gilbard的方法进行改进，采用手术用烧灼器直接烧灼睑板腺开口，使操作更简便、快速。在术后第6周左右就可出现明显的虎红染色及角膜荧光素染色等干眼体征。    本实验采取肖启国等制作蒸发过强型干眼模型的方法，在第6周时，根据测得BUT、Schimer Ⅰ试验以及角膜虎红染色结果确定达到干眼诊断标准。通过放射免疫和酶联免疫的方法检测正常兔和模型兔泪液中IL-6、TNF-α含量对比，可以看出，蒸发过强型干眼模型形成后，实验组与对照组相比较，两种细胞因子的含量显著增高，经统计学分析，差异有显著性统计学意义。    由本实验还观察到，ICAM-1在两组兔角膜、结膜上皮均有表达，阳性反应物呈棕黄色，主要表达于细胞浆。每1000个细胞阳性表达数实验组与对照组比较，ICAM-1的表达明显增加。ICAM-1分子分布广泛，如白血球、内皮细胞、某些肿瘤细胞、上皮细胞、肝细胞、平滑肌细胞等，IL-6、TNF-α等细胞因子均可促进ICAM-1分子的表达。正常角膜中，ICAM-1不表达或很低水平地表达于角膜缘血管内皮细胞[11]，炎症或免疫反应可上调ICAM-1的表达[12]。IL-6和TNF-α同属细胞因子网络中的核心成员，TNF-α为IL-6的强诱导剂，而IL-6和TNF-α的表达增加又上调ICAM-1的表达，三者互相促进又相辅相成，是眼表免疫反应发生的标志。    由本实验的结果看出，在蒸发过强型干眼中三种细胞因子的含量均有增高，由此推测由睑板腺功能障碍引起的蒸发过强型干眼不单纯由睑板腺的阻塞或分泌异常引起，也与细胞因子的增加及免疫反应有关。但是由于本实验的局限性，对三种因子在干眼病损过程中是如何发挥作用未进行深入的研究，因此，进一步研究三种因子在发病过程中如何发挥作用以及如何对细胞因子的分泌进行有效的调控，此对蒸发过强型干眼的预防、治疗及防止复发具有重要的意义。【参考文献】[1] Pflugfelder SC. 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