凋亡相关基因Bcl2和细胞因子bFGF在豚鼠透镜诱导近视眼中的研究

作者：王红 陶远 作者单位：山东大学齐鲁医院眼科， 山东 济南 250012   【摘要】  目的：探讨B细胞淋巴瘤/白血病2基因（Bcell lymphoma/leukemia 2，Bcl2）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）在透镜诱导豚鼠近视眼后极部巩膜细胞中的表达，以及二者对巩膜细胞凋亡的影响。方法：选健康4周龄豚鼠45只，随机分成3组，Ⅰ组（右眼配戴20D）、Ⅱ组（右眼配戴10D） Ⅲ组（不作任何干预）。实验前后用睫状肌麻痹下验光、A超动态观察豚鼠眼屈光度和眼轴长度，并取后极部巩膜组织，用电镜、终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导原位缺口末端标记法（TUNEL）和流式细胞术检测巩膜的凋亡细胞, 应用免疫组织化学染色和蛋白印迹（Westernblot）法检测bFGF和bcl2蛋白。结果:实验后诱导眼形成近视，且伴有眼轴延长。并在诱导眼巩膜细胞中检测到凋亡细胞，凋亡率高于对照组（P＜0.05)，透镜诱导的豚鼠近视眼后极部巩膜组织中bFGF和bcl2的含量降低（P＜0.05)。结论: bFGF与bcl2在透镜诱导豚鼠近视眼后极部巩膜细胞中表达阳性，并可通过抑制细胞凋亡参与透镜诱导豚鼠近视的形成。

【关键词】  近视 细胞凋亡 碱性成纤维细胞生长因子 B细胞淋巴瘤/白血病2基因 巩膜

      ［ABSTRACT］  Objective：   To explore the expression of Bcell lymphoma/leukemia 2 and basic fibroblast growth factor in lensinduced myopia sclera of guinea pigs and evaluate the effect of the two factors on apoptosis of the sclera cells. Methods: A  -20D concave or -10D concave lens was worn over the right eye in 30 fourweek old pigmented guinea pigs.  The eyes were periodically examined by retinoscopy, and Ascan ultrasonography. Two weeks later, the eyeballs were removed and the apoptotic cells were determined by electron microscopy, TUNEL technique and flow cytometry in scleras. Both bFGF and the bcl2 protein were determined by the immunohistochemisty method and the Westernblot method.  Results: All eyes treated with -10.00D or -20.00D concave lens  produced defocusinduced myopia. Axial lengths in lensinduced eyes remarkably increased compared with control eyes. Apoptotic cells were observed in fibroblasts of sclera in lensinduced eyes,  much more than in control eyes (P＜0.01). Expression of the bFGF and bcl2 protein was decreased (P＜0.01). With an increase of the diopter in the lensinduced myopia of guinea pigs, expression of bFGF and bcl2 was decreased. Conclusion: bFGF and bcl2 may play critical roles in guinea pig′s sclera with lensinduced myopia by adjustment of the apoptosis.

    ［KEY WORDS］  Myopia; Apoptosis;  Fibroblast growth factor2; Bcell lymphoma/leukemia 2;   Sclera

　　实验性近视眼主要分为透镜诱导近视（lensinduced myopia,LIM）和形觉剥夺性近视(form deprivation myopia,FDM),由于LIM被认为与人类近视眼有更多相似之处［1］,所以对该模型巩膜组织发生机制的探讨成为近视研究的重点。以往的研究中已经表明细胞凋亡在近视形成的过程中有一定的作用［2］,而碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）和凋亡抑制基因B细胞淋巴瘤/白血病2基因（Bcell lymphoma/leukemia 2 ，Bcl2）与细胞凋亡密切相关，本研究建立豚鼠的实验近视眼模型，应用电镜、流式细胞仪和终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导原位缺口末端标记法（TdTmediated biotin dUTP nickend labelling,TUNEL） 对凋亡的细胞作定性、定量检测。并应用免疫组织化学染色和蛋白印迹法（Westernblot）对透镜诱导豚鼠近视眼的巩膜组织进行bFGF和Bcl2蛋白的检测，探讨bFGF和Bcl2在实验性近视眼中的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  近视模型制作  选择4周龄的健康花色豚鼠45只(山东大学实验动物中心提供)，随机分为3组，每组15只，Ⅰ组豚鼠右眼戴-20D透镜，Ⅱ组右眼戴-10D透镜，Ⅲ组为正常对照组，双眼均不处理。室内饲养,自然昼夜周期,室温24 28?℃。

    1.2  眼屈光度的测量  Ⅰ、Ⅱ组豚鼠戴透镜前和戴透镜2周后检查眼屈光度，双眼滴0.5%托比卡胺眼水以麻痹睫状肌,30?min后，用带状光检影镜测眼屈光度，用A超测量眼轴长度。

    1.3  组织的取材与分离  将3组豚鼠注射空气处死，于角膜的中央水平径线处的鼻侧和颞侧角膜缘作标记，沿角膜缘剪开球结膜，立即摘除双侧眼球，沿角膜垂直径线剪开，1/4眼球置入快速固定液中固定；1/4眼球用剪刀沿赤道部环行剪开眼球壁，去除眼前节组织和玻璃体，用无齿镊剥离巩膜，取后极部巩膜组织3?mm×3?mm一块，置入25?g/L戊二醛溶液中固定,备于电镜检查；1/4眼球用于Westernblot检测；另1/4眼球用于流式细胞仪检测。

    1.4  TUNEL技术检测巩膜凋亡细胞  TUNEL试剂盒购于福州迈新公司，操作步骤严格按说明书进行。切片常规脱蜡、水化，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。蛋白酶K消化后，在末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）作用下把地高辛标记的脱氧尿苷酸连接到凋亡细胞DNA的3′OH末端，再用生物素化地高辛抗体放大信号，DAB显色。苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，光镜观察。TUNEL染色阳性对照片为DNase 1?mg/ml作用10?min;阴性对照为反应液中不加TdT。

    1.5  电镜观察  每组随机选3只眼球，取眼球后部颞侧眼球壁巩膜组织切成1?mm×1?mm大小组织块,25?g/L戊二醛溶液中固定,10?g/L锇酸固定,各级酒精及丙酮脱水,浸透包埋、固化,超薄切片(50 60?nm),枸橼酸铅染色,JEM1200EX透射电镜观察、拍片。

1.6  流式细胞仪检测巩膜的凋亡细胞  剥离的后极部巩膜PBS漂洗后，放入盛有适量PBS的平皿中，剪碎组织块，吸管吹打，0.25%胰蛋白酶消化，200目筛网过滤，1?000?r/min离心0.5?min，去上清，PBS洗涤，调细胞浓度为1×106个/ml, 用荧光素标记的连接素V/碘化丙啶(AnnexinVFITC/PI)染色，流式细胞仪检测。

    1.7  免疫组织化学检测bFGF和bcl2  兔抗bFGF和bcl2多克隆抗体及SABC试剂盒购于福州迈新公司。染色步骤按SABC试剂盒内说明书进行，兔抗bFGF和bcl2多克隆抗体工作浓度为1∶100，由福州迈新公司提供的bFGF和bcl2的阳性组织片作阳性对照。以PBS代替一抗，作阴性对照。

    1.8  bFGF和bcl2蛋白印迹法检测  在冷的RIPA缓冲液中处理3组眼球剥离的后极部巩膜，置于含有酶抑制剂的细胞溶解缓冲液(150?mmol/L NaCl、1NP40、0.5去氧胆酸及50?mmol/L Tris HCl,ph8.0)中,室温下1?h,离心10?min(13?000?r/min),取上清液,检测蛋白浓度。

    将同一蛋白浓度的待测标本、阳性对照及阴性对照样本煮沸3?min,分别加入4% 15%十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶,电泳45 60?min(电压200?Ｖ)。将带有蛋白带的凝胶转移至硝酸纤维膜,在90?Ｖ电压下转移1?h,将其置于3%无脂牛奶中1?h(去除非特异性染色)后取出,加第1抗体(抗体稀释液:1%小牛血清、Tris盐溶液、0.5Tween20)于硝酸纤维膜,室温下1?h,漂洗3次后加HRP标记的抗1抗体,再置室温1?ｈ,漂洗3次,用放射自显影法显影检测bcl2、bFGF蛋白条带，Kodak X胶片摄影。Western blot方法显示的蛋白带密度直观进行比较后，用ECL增强检测系统检测强度并经电脑分析。

    1.9  结果判定  由2名病理科医生采用双盲法独立观察，每张切片观察10个视野，bFGF和bcl2的阳性效应产物为棕黄色颗粒，分布于后极部巩膜组织细胞浆中。TUNEL结果判断及标准: TUNEL (POD)阳性细胞着色为棕黄色，定位于胞核内,少数胞浆内出现阳性颗粒。TUNEL染色阳性且在光镜下符合凋亡细胞形态特征：胞质、染色质浓缩，体积缩小。TUNEL阴性细胞为细胞核无棕色着色。利用HPIAS1000高清晰度彩色病理分析系统，用彩色分割方式测定每个视野中的阳性细胞面积，计算阳性细胞面积占每个视野组织面积的百分比。应用凝胶分析系统软件对蛋白含量作定量分析，扣除背景荧光，最终结果为bFGF和bcl2 蛋白与内对照βactin比值的平均值。

    1.10  统计学处理  采用SAS统计分析软件对透镜诱导豚鼠近视屈光度和眼轴结果行t检验。 对3组凋亡率、bFGF和bcl2免疫组化阳性率及westernblot结果，应用配对t检验进行统计学分析。

    2  结  果

    2.1  透镜诱导豚鼠近视屈光度数和眼轴长度结果  实验前3组动物双眼的屈光度数和眼轴长度相匹配，差异无统计学意义（P＞0.05）。 实验后各组动物双眼的屈光度数和眼轴长度见表1。实验后3组双眼远视屈光度数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），3组眼轴均延长，差异有统计学意义（P＜0.05）。Ⅰ组 、Ⅱ组分别诱导出近视,且眼轴分别延长了（0.45±0.11）mm和（0.39±0.19）mm,两组差异有统计学意义（P＜0.01）; Ⅰ组、Ⅱ组诱导眼和对照眼实验前后屈光度和眼轴长度差值的比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

    2.2  透镜诱导豚鼠近视眼巩膜细胞凋亡的检测结果  对照组应用TUNEL法染色未检测到凋亡细胞，Ⅰ组和Ⅱ组分别配戴-20D和-10D透镜14?d后，豚鼠诱导眼后极部巩膜中出现TUNEL染色阳性的凋亡细胞核，呈棕黄色或棕褐色，凋亡率显著高于Ⅲ组，差异有统计学意义（P＜0.05）；见表2。透射电镜检测到Ⅰ、Ⅱ组的巩膜成纤维细胞凋亡数量增多，主要表现为：细胞分布不均匀，细胞形态不一, 细胞内空泡形成，线粒体肿胀，扩张的内质网与细胞膜融合,部分细胞皱缩，细胞核固缩，染色质固缩周边化，形成新月形,马蹄形,镰刀状及柳叶形等改变，并可见典型凋亡小体。Ⅲ组未见典型凋亡细胞。

    2.3  透镜诱导豚鼠近视眼巩膜组织中bFGF和bcl2蛋白的表达  3组后极部巩膜组织免疫组织化学实验均能检测到bFGF、bcl2蛋白（见图1，图2），Ⅲ组bFGF、bcl2蛋白阳性表达率明显低于Ⅰ、Ⅱ组（P＜0.05），Ⅱ组明显低于Ⅲ组（P＜0.05），随诱导近视程度的增高，bFGF、bcl2蛋白的表达率出现明显下降，差异具有统计学意义。Westernblot法检查结果：经ECL系统分析，3组bFGF蛋白与内对照βactin比值的平均值分别为：0.61±0.02、1.1±0.06、1.63±0.13，3组bcl2蛋白与内对照βactin比值的平均值分别为：0.71±0.03、1.26±0.05、1.51±0.17，其结果与免疫组织化学实验结果一致。图1  光镜下豚鼠巩膜组织成纤维细胞bFGF（A）及bcl2（B）染色阳性（×400）

    3  讨  论

    实验性近视最突出的表现是实验眼的眼轴延长，所以对巩膜组织中成纤维细胞的组织学、生化和分子生物学研究显得非常重要［3］。豚鼠巩膜的结构与人类巩膜相似，豚鼠近视眼伴有后极部巩膜变薄，与其它哺乳动物的实验性近视眼的改变相似，并且豚鼠形觉剥夺性近视眼巩膜代谢的研究发现，巩膜的硫化糖胺多糖和羟脯氨酸含量明显降低，表明巩膜蛋白多糖和胶原等细胞外基质含量减少，巩膜变薄，易于扩张，眼轴延长，形成轴性近视，这些变化接近人类近视眼巩膜的改变［4］。

    本研究通过对豚鼠进行负透镜的单眼诱导，成功地建立了豚鼠实验性近视模型，表明了豚鼠对透镜诱导的离焦是敏感的。由于透镜的配戴，使视网膜成像发生改变，干扰了豚鼠对视网膜的感知，从而产生了离焦信号，此信号通过多种途径经过信号的传递过程最终作用于巩膜，下调巩膜胶原和糖蛋白的合成，使巩膜细胞外基质含量发生变化，从而引起眼轴的变化［5］。

    以往的研究表明，在透镜诱导豚鼠实验性近视眼的巩膜组织中存在细胞凋亡［2］。在实验性近视眼巩膜发生的一系列病理改变中，我们认为其发生机制是包括细胞凋亡在内的多种因素所造成的，而这些多种因素之间又有着相互的联系。对实验性近视眼发病机制的研究应该是对这些相互关系的观察和探索。

bFGF作为一种强有力的促细胞增殖、分化和存活的营养/生长因子,与肿瘤、胚胎发育、变性、以及血管异常性病变等疾病间的关系,已得到生物医学界的广泛研究和多学科的重视。以往的研究着重于bFGF对细胞增殖的促进作用，有助于损伤、炎症组织的恢复及免疫调节［6］。bFGF除了促细胞增殖外,还可抑制细胞凋亡［79］。1984年Tsujimoto等［10］从B细胞淋巴瘤染色体易位t（14；18）（q32；q21）断裂点处发现bcl2（B cell lymphoma /leukemia 2）的。它最初是从人的滤泡性B淋巴细胞中分离出来的，定位于人第18号染色体。迄今的研究表明，bcl2通过抵抗多种形式的细胞凋亡而延长细胞的寿命［11］。Seko等［12］研究证实近视眼巩膜中bFGF的含量减少。Rohrer等［13］研究报道结膜下注射和玻璃体腔注射bFGF均能阻止鸡形觉剥夺性近视的眼球的过度生长。还有研究显示，bFGF阻止形觉剥夺性近视的发生具有剂量依赖性［14］。

    在实验性近视眼巩膜组织中以往的研究已证实存在bFGF 的下降，那么在巩膜组织中是否存在bcl2 的下调。本研究采用免疫组织化学实验和蛋白印迹法实验结果发现：在透镜诱导豚鼠近视的后极部巩膜组织中存在着bFGF和bcl2蛋白，且随着近视程度的增高，二者的含量出现进行性下降。诱导眼bFGF的阳性率低于对照组的阳性率，说明豚鼠透镜诱导近视眼巩膜中bFGF的含量减少，活性降低，因而其阻止近视发展的作用减弱，使眼轴延长。透镜诱导豚鼠近视眼巩膜组织中bFGF的变化趋势与形觉剥夺性近视眼的变化一致，说明透镜诱导近视眼的形成和形觉剥夺性近视眼的发生，在巩膜生长因子的变化上是相同的，表明两种类型的近视眼形成中，生长因子的调节存在相似的机制。另外，透镜诱导豚鼠近视的后极部巩膜组织中bcl2出现表达，其阳性率低于对照组，提示在透镜诱导豚鼠实验性近视眼的后极部巩膜组织中bFGF与bcl2 二者的下降与实验性近视眼巩膜组织变薄的病理改变有着重要关联。

    透镜诱导豚鼠实验性近视眼后极部巩膜细胞中bFGF和bcl2基因的下降是导致细胞凋亡率的增加的一个重要原因，而透镜诱导豚鼠近视眼巩膜细胞凋亡率的增加是引起近视眼巩膜组织变薄等一系列病理改变的原因之一。对实验性近视眼细胞凋亡的更深入研究，尤其是细胞凋亡中信号传递机制的研究，将是攻克近视发病机制和防治近视的一个重要课题。

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