小鱼眼球视网膜组织石蜡切片的制作方法
发表时间：2009-06-29 浏览次数：815次
作者：谢玲 张志平 林坚涛 王以尧 作者单位：广东医学院组胚教研室；广东医学院药理学教研室，广东湛江524023；广东海洋大学水产学院渔业资源实验室，广东湛江 524088 【摘要】 目的 观察小鱼眼球（直径在0.3cm左右）视网膜组织石蜡切片的制作方法。方法 鲻鱼和罗非鱼各5条，采得眼球20个，用体积分数（下同）95%乙醇85mL+10%中性甲醛10mL +冰醋酸5mL混合而成的FAA固定液进行固定；脱水前先用医用7号针头刺破眼球后再进行脱水、透明、石蜡包埋、切片和HE染色，最后在光镜下观察结果。结果 20个眼球的视网膜组织结构和层次均基本保持完整，细胞形态清晰。结论 0.3 cm左右直径的鱼类小眼球用FAA固定液固定和针刺破眼球后脱水法制作石蜡切片方法是可行的。
【关键词】 鱼眼球；视网膜；显微切片术
眼球是一个构造较为复杂的球形体，巩膜为致密结缔组织，视网膜柔软容易脱落，晶体很坚硬，玻璃体为胶状物，各部分的结构微细，故在制作石蜡切片时较一般组织困难［1］。通常使用传统的火棉胶包埋或双重包埋法，不但费时间，且成本高，同时切片较厚，不能适应实际需要。我们在各种鱼类眼疾病的检验过程中，发现小鱼眼球（直径0.3cm左右）的视网膜很薄、很柔软，制作切片时更易凹陷、脱落与变形，经我们反复试制，最后采用FAA固定液固定，针刺穿眼球后再脱水的石蜡切片法的效果较为满意，现将我们的方法和结果作一报道，供同道参考。 1 材料和方法 1.1 材料 取新鲜鲻鱼和罗非鱼各5条，共取眼球20个（眼球直径0.3cm左右）。在解剖镜下取材后用小眼科剪修剪眼球周围的多余组织。 1.2 固定 FAA固定液配方［2］：体积分数（下同）为95%乙醇85 mL+10%中性甲醛10 mL+冰醋酸（分析纯）5mL，将上述3种溶液混匀后备用。 修剪好的眼球立即用固定液固定24h。因固定液无色，固定后可不洗涤，直接浸入80%乙醇中进行脱水或作保存。 1.3 室温脱水与透明 从固定液取出小眼球，先用医用7号针头在眼球上下两侧各刺（针刺方向应与视神经乳头平行）1个小洞，然后整个眼球依次浸入不同体积分数的乙醇中脱水：80%24h→90% 6～8h→95% 6h→95% 6h→100% 45 min→100% 45 min，再浸入加二甲苯的100%乙醇（按1∶1混合）15min→二甲苯 15min→二甲苯 15min进行透明。 1.4 浸蜡与包埋 透明后的组织在加二甲苯的软蜡（按1：1混合，56～58℃）中浸30min→蜡Ⅰ（56～58℃）浸1h→蜡Ⅱ（58～60℃）浸1h，继而用石蜡（56～58℃）包埋（包埋时角膜向上）。蜡块冷却后即可修整、切片，亦可保存于4℃冰箱内。 1.5 切片与染色 蜡块行眼球水平位连续切片，厚度为4～6μm，然后将切片置56～60℃烤箱内烤12～24h后行常规脱蜡、反水和HE染色（苏木精浸染10 min→水洗去浮色→1%盐酸乙醇分色→自来水碱化30 min→70%乙醇2 min→80%乙醇2 min→浸染伊红乙醇5 min→95 %乙醇分色）。然后再常规脱水、透明、封片（用中性树胶。为保持树胶为中性和切片不易退色，我们通常在树胶瓶内加入适量的大理石碎石），最后用光镜观察。 2 结果 20个眼球的视网膜组织的结构和层次均基本保持完整，细胞形态清晰，除2个眼球染色较差外余均染色良好，见图1、2。 图1 视网膜（HE染色，4×10）（略）
图2 视网膜（HE染色，40×10）（略）
3 讨论 在制作视网膜石蜡切片时，要注意如下几点：（1）眼球取材一定要新鲜、固定及时，否则，视网膜极易剥离。鲻鱼或罗非鱼的眼球小，直径一般都在0.3cm左右，视网膜很薄，极易变形，故取材时应特别小心防止刀剪伤及眼球，特别在修剪眼球多余组织时勿伤角膜及其它眼球本身组织以免眼球塌陷。（2）FAA固定液中的乙醇和冰醋酸都具有穿透力强、作用快的优点，甲醛和乙醇具有固定、脱水的相互协同作用，冰醋酸还可使组织轻度膨胀以减少乙醇对组织的高度收缩和硬化［24］。（3）我们在固定后以医用7号针头刺穿眼球是为了快速、完全脱水及透明、浸蜡。应指出的是：为不使眼球受损和凹陷，应选新针头为好，以保证迅速刺破眼球壁。此外，在脱水过程中应常常轻轻摇动，以促使各种浸剂进入到眼球内。（4）二甲苯作透明剂的效果比较强烈和快速，应掌握好透明的时间，既要完全透明，又不可过度，一般约30～40min为宜（眼球已完全下沉，说明液体已全渗透组织中）。若采用氯仿作透明剂则需12～15h，该法虽时间长但比较稳定。（5）组织浸蜡前应先浸入加二甲苯的软蜡（按1∶1混合）中，目的是促使眼球在透明的同时便于石蜡的浸入。石蜡的熔点以软蜡56～58℃、硬蜡58～60℃为宜。当观察到眼球完全下沉则说明蜡已浸入眼球组织，浸蜡成功。另外，包埋蜡应与浸蜡的熔点（58～60℃）一致，这样才能使蜡块在切片时不易引起组织与石蜡的分离而造成摊片的困难。在夏日气温较高时可将蜡块放4℃冰箱内冷冻后再切片为好。如蜡块暂不切片，可放入4℃冰箱内保存。（6）切片刀要锋利，最好用一次性刀片作连续切片，切片还应置于60℃烤箱中烤12～24h，以防在染色过程中掉片。若在切片过程中出现空泡现象，可进行重浸蜡，一般时间为15～30min。一般情况下，常规HE染色是可行的，可以观察到组织完整的结构。由于眼球各层组织细胞成分不同，其质地的软硬程度也不同，故在制作石蜡切片的每一步骤中都要防止眼球收缩而引起视网膜凹陷、变形、剥离和组织变硬、变脆等。
【参考文献】 ［1］ 胡登,王文秀,杨森,等.组织学特殊染色技术实践［M］.西安:陕西师范大学出版社,1989:214.
［2］ 凌启波.实用病理特殊染色和组化技术［M］.广州:广东高等教育出版社,1989:319.
［3］ 何春燕,王伟然.福尔马林、酒精、冰醋酸混合液与常规福尔马林固定液固定病理切片技术的效果比较［J］.广东医学院学报,1997,15(2):192.
［4］ 张文忻,李永平,林健贤,等.冰醋酸固定液对视网膜组织固定效果的探讨［J］.眼科学报,2006,22(2):112114.
