单眼形觉剥夺对豚鼠后极部巩膜整合素β1表达的影响

单眼形觉剥夺对豚鼠后极部巩膜整合素β1表达的影响作者：朱子诚，张金嵩，柯根杰，李秀娟，籍雪颖    作者单位：安徽医科大学附属省立医院 眼科，安徽 合肥 230001    【摘要】  目的 探讨豚鼠形觉剥夺性近视模型中巩膜整合素β1的表达及其与形觉剥夺的关系。方法 40只出生后1周花色豚鼠，右眼遮盖作为形觉剥夺组，左眼不作处理作为对照组。遮盖2、4、8周和遮盖8周去遮盖1周后测量屈光度，眼科A超测定眼轴长度；对两组4个时间点眼球后壁行SP法免疫组织化学染色和RT-PCR检测巩膜整合素β1蛋白和mRNA水平的动态变化。结果 与对照组相比，形觉剥夺组4个时间点眼球后壁巩膜整合素β1表达明显减少，差异有统计学意义（P<0.05），去遮盖1周后，表达上调，但仍低于对照组(P<0.05)；而对照组间相比较，差异无统计学意义(P>0．05)；形觉剥夺组和对照组屈光度、眼轴长度比较，差异有显著的统计学意义(P<0.05)。结论 豚鼠形觉剥夺时，后极部巩膜整合素β1表达减少，去遮盖后表达上调，提示整合素β1可能参与了形觉剥夺性近视的发生，其影响巩膜重塑的机制有待进一步研究。    【关键词】  形觉剥夺性近视；巩膜；整合素β1；豚鼠    研究表明，轴性近视形成极可能是后极部巩膜主动重塑的结果[1]，其中巩膜细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成与代谢之间的平衡失调可能为其始动原因。研究证明[2-3]，整合素(integrin)对细胞与细胞之间、细胞与ECM之间的功能维持，以及ECM的合成与代谢均具有非常重要的作用。最近Ravikanth等[4]报道，树猪巩膜中存在多种整合素受体表达，且其基因序列与人高度一致。因此，本试验选择豚鼠巩膜作为研究对象，采用免疫组化染色法、RT-PCR法观察和研究近视发生、发展中巩膜整合素β1的蛋白和mRNA变化，以期探讨形觉剥夺对豚鼠后极部巩膜整合素β1表达的影响，为进一步研究整合素及整合素受体在近视眼巩膜主动重塑中的作用及其机制提供理论依据。1  材料和方法    1.1  豚鼠形觉剥夺性近视模型的建立及分组  动物及分组：出生后1周的新生健康花豚鼠40只，排除眼疾，托品酰胺点眼后检影验光，排除先天性近视。实验组分为4组，每组10只。右眼半透明眼罩遮盖2、4、8周及遮盖8周去遮盖恢复1周为形觉剥夺组，另一只眼作为对照眼不进行任何处理。实验动物由郑州大学基础医学院实验动物中心提供，在自然照明室内环境下饲养。    1.2  观察指标和方法    1.2.1  屈光度、眼轴长度测量  所有实验动物在实验前和不同时间点时在睫状肌麻痹状态下用带状光检影，结果记录为等值球镜屈光度(球镜屈光度+1／2散光度)。A超测定双眼眼轴长度，由专人测量。    1.2.2  SP免疫组织化学染色法检测巩膜整合素蛋白表达  在4个实验组中各取6只豚鼠验光及测量眼轴，然后处死，摘除眼球，予常规石蜡包埋。所有组织蜡块于近后极部连续切片7张，每张切片厚5 μm，1张用于苏木精-伊红染色，1张作阴性对照，5张用于免疫组化染色（integrin β1兔抗鼠多克隆抗体：博士德公司）。随机分别选取后部巩膜各10个部位进行图像扫描，用平均光密度值表示整合素的相对蛋白表达量。评价者遵循双盲原则。    1.2.3  巩膜组织中整合素β1 mRNA 检测  采用二步RT-PCR法：取另16只豚鼠，予以氯胺酮深度麻醉后快速摘除眼球，分离巩膜，置液氮罐，转移至-80℃ 冰箱保存。取冻存组织标本至匀浆器中，加l ml Trizol快速研磨2~3 min，直至组织成为匀浆，常规提取总RNA。逆转录获得cDNA。以cDNA为模板，PCR 扩增的整合素β1目的基因应用Oligo 6.0基因分析软件设计引物，引物由北京奥科公司设计合成。整合素β1上、下游引物分别为：5′-GGA GGA GGC ATT CGG AAA GTA-3′，5′-CTG CAG GTC GTT GGT GTC AC-3′，产物片段长为181 bp；内参β-actin上、下游引物分别为：5′-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3′，5′-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT－3′，产物片段长为300 bp；PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环后，72℃延伸5 min。取产物5 μl与上样缓冲液混合后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。用图像分析仪(Gene Genius美国syugene)分析处理。测定整合素β1／β-actin光密度值，分析整合素β1在巩膜中的mRNA相对表达水平。    1.3  统计学方法  应用SPSS12.0统计软件包，双眼比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。2  结果    2.1  眼屈光度、眼轴长度  出生不久，豚鼠呈远视状态，眼轴短，双眼屈光度、眼轴差异无明显统计学意义(P>0.05)。随形觉剥夺时间延长， 遮盖眼组屈光度由实验前远视渐变为近视，眼轴明显增长。对照眼远视度数略有减低，眼轴略有延长。遮盖眼组屈光度数、眼轴长度与对照眼比较，差异具有显著的统计学意义(P<0.05)。见表1。    2.2  SP法检测巩膜整合素β1表达  在正常情况下，巩膜成纤维细胞内阳性细胞胞浆为棕黄色，染色明显。在豚鼠视觉剥夺后，随遮盖时间延长，巩膜整合素β1表达逐渐下调，胞浆着色减弱，与对照眼差异有显著统计学意义(P<0.05)。见表2和图1~图3。    2.3  巩膜整合素β1 mRNA RT-PCR检测  豚鼠巩膜整合素β1表达产物片段长分别为181 bp，内参照β-actin为300 bp。正常对照眼巩膜有整合素β1 mRNA表达，形觉剥夺后整合素β1 mRNA表达下调，两组比较，差异有显著统计学意义(P<0.05)。见表3和图4。3  讨论    由于人类形觉剥夺导致近视眼发生的比例很低，大多数近视眼是由于离焦导致正视化过程紊乱所致，因此，近年来有学者对形觉剥夺性近视（form deprivation myopia，FDM）模型的临床意义提出质疑。但研究发现[5]，虽然形觉剥夺和离焦信号导致近视产生的机制不同，最后导致的病理改变却相似，因此，采用FDM模型研究巩膜重塑的变化同样具有临床指导意义。    轴性近视发生时存在巩膜胶原的主动重塑，主要发生在后部巩膜，造成眼球主动扩张，而非简单的被动延伸，这一结论已被认可[6-7]。由于胶原变化在近视发生中的重要作用[7-8]，检测影响胶原合成和降解的关键因子十分必要。    整合素与巩膜ECM代谢、功能表达密切相关。特别是Ravikanth等[4]最近首次报道，树猪巩膜中存在多种整合素受体表达，且其基因序列与人高度一致。同时，研究表明[9-10]，整合素受体α1β1、α2β1与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表达与活性密切相关，而MMPs，特别是MMP-2被认为是FDM后极部巩膜ECM主动重塑的“早期启动因子”之一[11]。目前，在近视形成中，有关整合素在巩膜重塑中的变化和作用的研究少见报道，本研究采用已被证实的半透明眼罩诱导近视动物模型，应用免疫组化染色法、RT-PCR法观察和研究近视发生时巩膜整合素β1的蛋白和mRNA变化，旨在为近视的研究提供新的思路。    本实验应用SP免疫组织化学方法，从蛋白质水平检测整合素β1在形觉剥夺性近视巩膜中的动态表达。结果显示，在正常情况下，巩膜成纤维细胞内阳性细胞胞浆为棕黄色，染色明显。在豚鼠视觉剥夺后，随遮盖时间延长，巩膜整合素β1表达逐渐下调，胞浆着色减弱，与对照眼相比，差异具有显著统计学意义(P<0.05)，表明形觉剥夺时后极部巩膜整合素β1表达减少，去遮盖后表达上调，提示整合素β1可能参与了形觉剥夺性近视的形成与发展。    大量研究证明，整合素不仅可以介导细胞与细胞之间、细胞与ECM之间的黏附，而且对细胞与细胞之间、细胞与ECM之间的功能维持，以及ECM的合成与代谢均具有非常重要的作用。其中整合素α1β1主要与基底膜的胶原Ⅳ型和胶原XIII型结合，整合素α2β1与纤维状的胶原如Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型有关，由于巩膜中主要的胶原成分是Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型，整合素α2β1受体可能是巩膜纤维受体中最关键的因子[4]。本研究所用的整合素β1抗体可以与多种整合素α活性亚单位结合，其结果可以反映出巩膜整合素蛋白的变化和对巩膜重塑的影响。    为进一步了解形觉剥夺对巩膜整合素β1的影响机制，本研究应用半定量RT-PCR技术从mRNA水平检测整合素β1在FDM中的动态变化。结果显示，形觉剥夺致近视后巩膜整合素β1 mRNA水平表达随时间延长而下降，与对照眼相比差异有统计学意义(P<0.05)，去遮盖恢复1周后，遮盖眼巩膜整合素β1 mRNA的表达明显上调，但与对照眼相比仍处于较低水平。此结果表明，形觉剥夺眼去遮盖后，随着近视程度的减轻，巩膜整合素β1 mRNA的表达水平又恢复升高，且与整合素β1的蛋白表达改变有一致性。提示形觉剥夺可下调巩膜整合素β1基因的转录水平，进而导致整合素β1蛋白合成的减少，通过级联效应引起巩膜主动重塑，眼轴延长，形成近视。    综上所述，本实验证明形觉剥夺使后部巩膜整合素β1表达减少，结合以前的研究[4，12]，我们推测，在形觉剥夺时巩膜胶原纤维的改变可能与整合素水平下调有关，导致胶原和蛋白多糖在细胞外基质中生成及聚集减少，引起巩膜机械特性发生改变，伸展性增高，抗张力降低，从而导致眼轴增长，近视形成，其具体机制有待进一步研究。【参考文献】  [1] Curtin BJ. 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