乌司他丁对大鼠心肺脑复苏后早期海马兴奋性氨基酸的影响

乌司他丁(UTI)是一种广谱蛋白酶抑制剂,有研究[1]表明,UTI对心肺复苏(CPR)后脑组织具有保护作用。近年来,对UTI脑保护作用机制有诸多新发现,UTI对CPR后脑组织海马兴奋性氨基酸 (EAAs)影响的研究报道较少。本研究采用窒息法制作大鼠即刻CPR模型,观察应用UTI对大鼠海马组织EAAs含量和海马病理损害的影响,探讨UTI 对即刻CPR大鼠模型早期脑损伤的治疗作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 MPS0多参数监护仪(飞利浦德国)、HX-300s 动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)、高效液相色谱仪(Wate鸭ez⒆ 5,UⅤ -⒉⒆ 紫外检测器,z75荧光检测瑁藩)、色谋拿本主 (SUPELCOsIL LC - 18; 250mm× 4.6mm,5u狃,sIGMA)、Empowσ 3讵巳谱工作站。乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司, 批号:∞ 090921)、氨基酸对照品:谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸(生化试剂,纯度均)98%)、AccQ· Flu。r 氨基酸衍生试剂盒(美国W乱e鸦公司,包括AQC粉末2A、2B和硼酸盐缓冲液),乙腈和甲醇为色谱纯; 其他为分析纯试剂。

1.2 实验动物与分组 成年健康雄性sD大鼠szI 只(由新疆维吾尔自治区疾病控制中心动物研究所提供),许可证号:mⅨΚ(军)2007-陇3,清洁级,体质量280~320g。采用随机数字表法随机分为假手术组(S组)、生理盐水复术组(NS组)和乌司他丁复术组(UTI组);每组18只。每组又分为0.5h、 1,0h、2,0h三个亚组(每个亚组6只)。术前禁食 ⒓ h,不禁水。

1.3 大鼠CPR模型的建立 采用窒息法并加以改进建立大鼠CPR模型[2]。实验参数设计和记录均参照复苏实验研究的LTtstein模式[3]。3%戊巴比妥钠(35mg/吒)腹腔注射麻醉,将动物仰卧固定于手术台上,分离左侧颈总动脉,结扎远心端,向近心端置入” 号套管针连接压力换能器,使用MPs0多参数监护仪监测有创动脉压,标准肢体导联心电图,给气管切开置管。大鼠手术后室温下稳定10min,NS 组和UTI组于呼气末夹闭气管导管,窒息6~7 血n,待大鼠心跳停止后立即开放气道,进行CPR: 连接HX-⒛0S动物呼吸机行机械通气(口乎吸频率 SO犯/min,潮气量8mL/吒,氧浓度100%),同时行胸外心脏按压,按压频率160犯/血n,按压深度为大鼠胸廓前后径的1/3,同时经颈动脉推注肾上腺素 ⒛ u酽kg,必要时追加同等剂量,直至自主循环恢复 (ROSC)。UTI组在ROSC后2血n内经左颈总动脉推注乌司他丁10万U/kg,NS组推注等量生理盐水。s组大鼠仅行麻醉、气管插管和左颈总动脉穿刺,不给予任何液体输入。

1.4 成模标准 参照Kam。hara等[4]标准,心搏骤停判断标准:心电图呈室颤、停搏或电机械分离,颈动脉平均动脉压<30mm Hg;ROSC判断标准:心电图呈自主节律,平均动脉压>ω mm Hg,持续时间超过10min。

1.5 兴奋性氨基酸的标本留取和测定

1.5.1 标本的留取 UTI组和NS组于ROSC后 0.5h、1h、2h,S组于气管切开后0.5h、1h、2h快速断头处死,于冰台上取右侧脑海马组织,称质量, 于液氮中保存。

1.5,2 EA热的测定 1.5.2.1 色谱条件 流动相A:7,4g无水乙酸钠, 加水叻0mL,冰醋酸调pH值6.5,加乙腈⒛ mL,混匀,用0.笱um滤膜过滤。流动相B:甲醇:乙腈:水为⒛:60:⒛ 。柱温:37℃ ;荧光检测:激发波长⒛5 nm,发射波长∞5nm;流速:1.0mL/椭n,线性梯度洗脱(T/B%):0而n,0;5血n,2%Ⅱ 0而n,5%;12 Ⅱ1in,0;20n1in,1009b。

1.5.2.2 氨基酸样品的处理及衍生反应 ′ ①海马称质量,加预冷的甲醇——水(1 )溶液1mL,冰浴匀浆;②低温离心(4℃ ,12O00r/血n,15血n),取上清液(可于-⒛ ℃储存)0,” um滤膜过滤;③采用AQC柱前衍生法,取脑组织匀浆上清液10uL, 力日AccQ· Flu。1·zA彳汀生试齐刂70uL,AccQ· Flu。1·zB衍生试剂10uL,涡旋混匀(3500√血n,30s);④温箱衍生(55℃ ,10而n);⑤进样5uL进行色谱分析。

1,6 海马组织的标本留取和病理观察 UTI组和 NS组于Ro℃ 后0.5h、1.0h、2.0h,S组于气管切开后0.5h、1.0h、2.0h快速断头处死,于冰台上迅速取右侧脑海马组织,置于10%甲醛溶液中固定z/I h后,制备为石蜡切片,HE染色,光镜观察并照相。

1.7 统计学处理 采用叩s17.0统计软件进行分析,计量资料以(死±s)表示,多组比较采用方差分析。方差齐性检验采用Levene’ s法,方差齐时组间均数比较采用ⅡD法,方差不齐时采用Tamhane’ s 检验,P(0.O~s为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高效液相荧光法测定EAAs含量 与S组比较,ROSC0.5h,UTI组和NS组大鼠海马组织中谷氨酸(αu)、天冬氨酸(Asp)和甘氨酸(Gly)浓度均显著升高(P<0.01)。与NS组比较,R0℃ 0.5h, UTI组大鼠海马组织中EAAs含量显著降低,以αu 最为显著(P(0。“ )。与S组比较,ROSC1~2h, UTI组和NS组αu浓度均逐渐降低,差异无统计学意义(P>0.O~s),羝p和Gly浓度显著升高(P< 0.01)。与NS组比较,ROSC1h,UTI组大鼠海马组织中EAAs浓度均降低,差异有统计学意义(P> 0.05)。与NS组比较,ROSC2h,UTI组大鼠海马组织中Glu和Asp浓度降低,差异无统计学意义(P) 0.05),Gly浓度升高(P胞排列较规则,细胞轻度肿胀,核周围淡染,核仁清晰(见彩色插页图14)。RO℃ 后2h,NS组海马神经细胞排列较规则,大小较均匀(见彩色插页图 16);UTI组海马神经细胞排列较规则,大小均匀,核仁清晰(见彩色插页图17)。

3 讨论

心搏骤停后的CPR过程是缺血-再灌注的过程,其引起的脑损伤涉及与能量代谢相关的诸多环节。即刻复苏早期也可能发生能量代谢紊乱[5],由此引起的兴奋性氨基酸释放增加可能是ROsC脑损伤的主要机制之一[610],通过改善CPR早期能量代谢障碍,减轻兴奋性氨基酸的神经毒性可能是脑保护的重要措施之一。目前,尚无此类特效药物。细胞间隙EAAs的转运驱动力依赖于Na+¨ Κ+-ATP 酶的维持,我们前期实验[5]发现,UTI可以改善CPR 早期的能量代谢紊乱,减轻脑组织病理学损伤,然而 UTI是否能通过能量代谢的改善而减轻EAAs的神经毒性尚不清楚。海马区是高级神经活动的重要部位,该区的神经细胞及神经胶质细胞对缺血的反应最敏感,因此,我们的研究通过观察大鼠即刻复苏模型对缺血、缺氧最敏感的海马CA1区EAAs的浓度及其病理学变化,进一步探讨UTI对即刻CPR可能的脑保护机制。

有研究[910]表明,细胞外EAAs如Glu、热p和 Gly的过多释放是神经细胞损伤的关键因素。其毒性作用涉及受体的过度活化、自由基的大量生成、能量代谢障碍等[11]。而其中αu含量占中枢神经末梢囊泡中EA热含量的ω%~70%,本研究发现,海马组织三种EAAs含量中G1u的浓度变化最明显, 且Glu变化趋势与光镜下海马病理学损伤的严重程度相一致。其中,Asp和αy含量虽然也有明显变化,但其浓度变化趋势与海马组织病理学损伤并不一致,推测海马组织病理的改变可能主要是由αu 浓度的改变所致,而A叩和G1y的作用并不占主导。

CPR强调早期(5min内)按压、即刻启动复苏, 可提高CPR的成功率,最大限度地减轻神经功能损伤[⒓ ]。然而,我们的研究还发现,即使是即刻复苏后0.5h,光镜下海马组织仍有细胞排列紊乱,部分神经元坏死、细胞水肿等表现;高效液相荧光检测证实,复苏成功后0.5h,UTI组和NS组的EAAs含量均显著高于S组;同时,我们发现,ROsC0.5~2.0 h,各组中海马组织Glu含量的变化趋势与各组光镜下病理学损伤的严重程度相一致。因此,我们认为,即刻CPR模型引起的脑内迅速升高的EAAs可能是其出现病理学损伤的重要机制之一。

UTI是一种广谱蛋白酶抑制剂,具有广泛的抑酶谱,研究表明,uTI可稳定细胞膜电位,稳定溶酶体膜,抑制脑复苏时自由基及炎症因子的产生。对于其CPR脑损伤的作用,我们前期实验发现,UTI 可增加即刻复苏模型ATP的含量,降低乳酸水平[5]。

本研究发现,UTI可降低EAAs含量,改善海马组织病理学损伤。我们认为,这可能是由于UTI 在心肺脑复苏早期减少了ATP的过度消耗,进而促进qTP的恢复,从而增加了ATP依赖型Glu转运体对Glu的摄取,减少了突触间隙Glu的蓄积,因此, 减轻了EA热的神经毒性。在本研究中,即刻后CPR后1h和2h,UTI组和Ns组光镜下海马组织病理学损伤逐渐减轻,αu 含量逐渐接近S组,UTI组αu含量低于Ns组,但两组差异无统计学意义。我们认为,可能与两方面因素有关:①UTI静脉注射后5血n达峰值,消除半衰期们而n,3h内血药浓度直线下降,因此,在即刻复苏1h后药效逐渐减弱;② 由于即刻复苏其损伤程度能在早期恢复相对正常的循环,通过机体自身调节达到αu的产生和摄取的相对平衡,从而降低了EAAs的水平,减轻了脑损伤。

综上所述,本研究发现,UTI可能是通过降低即刻CPR模型脑组织Glu浓度来减轻海马组织的病理学损伤,然而,其对于谷氨酸引起细胞损伤通路上的相关因素如N-甲基-D-天冬氨酸受体、细胞膜电位及细胞内Ca2+的影响还需进行进一步的研究。

参考文献

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