两种方法联合检测抗核抗体结果分析

　　抗核抗体（ANA）是最常出现于自身免疫性疾病（autoim.munedisease,AID）患者血清中的一组自身抗体的总称，其靶抗原为真核细胞的核成分，但也包括某些细胞质和细胞骨架成分。核抗原有3个组成部分，组蛋白、DNA、可溶性核抗原，后者是一组可溶于磷酸盐缓冲液（或生理盐水）中的多肽抗原，故名可提取的核抗原（exrtac.ablenuclearantigen,ENA），现已发现的有临床诊断价值的ANA超过10种，如：抗尿嘧啶。1低分子量核糖核蛋白（U1.nRNP），Smith抗原（sm），可溶性物质A、B（SS.A/SS.B），DNA拓扑异构酶1（Scl.70）、细胞质组酰。tR.NA合成酶（Jo.1）等[1],最常用的ANA检测方法有间接免疫荧光法、免疫扩散法、酶联免疫吸附法和蛋白质印迹法等[2],ANA和特异性自身抗体的检测在自身免疫性疾病的诊断中起重要作用[3],目前已有多家医院开展了自身抗体谱的联合检测。为探讨间接免疫荧光法与蛋白质印迹法对特异性ANA检测结果之间的相关性，以及两种方法联合检测在自身免疫性疾病诊断中的价值与优缺点。作者对2011年4月至2013年4月在本院皮肤科门诊就诊，且同时用上述两种方法检测ANA的患者资料及检测结果进行统计和对比分析。　　1 资料与方法　　1.1一般资料所有标本均来2011年4月至2013年4月在本院皮肤科门诊就诊且同时用间接免疫荧光法与蛋白质印迹法联合检测ANA的患者，共1018例，其中，女性810例，男性208例，男女比例为1∶3.89;患者年龄14个月至84岁。　　1.2标本采集严格按全国临床检验操作规程采集静脉血2mL,待凝后分离血清，置于2~8℃冰箱保存待检。　　1.3仪器与试剂仪器：日本OlympusBH2.RFCA荧光显微镜，江苏海门麒麟医用仪器厂生产的TS.8型转移脱色摇床，台式扫描仪及配套评价软件（由德国欧蒙医学实验诊断股份公司提供）。试剂：间接免疫荧光法检测试剂盒与蛋白质印迹法检测试剂盒均由德国欧蒙医学实验诊断股份公司生产。　　1.4检测方法与结果判断（1）间接免疫荧光法ANA检测：采用人上皮细胞（HEp.2）和灵长类肝脏冰冻组织切片两种基质联合检测患者血清中的ANA,通过特异性荧光模式判断荧光模型，根据血清样本稀释度及荧光强弱判断抗体滴度，检测过程均按试剂盒要求严格执行。（2）蛋白质印迹法ANA检测：试剂膜条包被有nRNP/sm（天然U1.nRNP）、sm、SS.A、SS.B、SCL.70、11.16多肽复合体抗原（PM.SCL）、Jo.1、着丝粒蛋白B（CENPB）、增殖细胞核抗原（PCNA）、抗双链脱氧核糖核酸（ds.DNA）、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白和E2酶和丙酮酸脱氢酶复合体蛋白X（AMA.M2）等抗原及质控带，可用于检测这14种不同抗原IgG类特异性抗体。检测过程严格按试剂说明书要求进行，实验完成后将膜条固定在绿色纸的黏性塑料膜上，干透后，用台式扫描仪扫描，并采用配套软件评价结果。　　1.5统计学处理利用Excel2003建立数据库进行数据处理及资料分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，以犘<0.05为差异有统计学意义。　　2 结果　　2.1间接免疫荧光法检测ANA结果（1）1018例标本共检出ANA阳性标本500例（49.12%），其中，208名男性患者共检出ANA阳性76例（36.54%），810名女性患者共检出ANA阳性424例（52.35%），女性患者ANA阳性率明显高于男性患者（χ2=16.55,犘<0.01）。（2）间接免疫荧光法检出的500例ANA阳性标本荧光模型分布情况见表1.　　2.2蛋白质印迹法检测ANA结果1018例标本共检出1924项特异性ANA阳性，至少一项特异性ANA阳性的标本775例，阳性率为76.13%,见表2.　　2.3两种方法检测结果比较间接免疫荧光法检出ANA阳性率明低于蛋白质印迹法（χ2=158.69,犘<0.01）。间接免疫荧光法检测ANA阳性标本中，有20例蛋白质印迹法检测为阴性。蛋白质印迹法检测ANA为阳性的775例标本中，有295例间接免疫荧光法检测为阴性（38.06%）。　　3 讨论　　在皮肤科较常见的自身免疫性疾病有系统性红斑狼疮、皮肌炎与多发性皮肌炎、局限性和系统性硬皮病、混合性结缔组织病、干燥综合征等[4].自身抗体是自身免疫性疾病的重要标志，患者血清中存在高效价的自身抗体是自身免疫性疾病的特征之一，也是临床确诊自身免疫性疾病的重要依据[5].狭义的ANA指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称，广义的ANA是一组针对多种细胞核、细胞质成分的自身抗体，包括细胞核、细胞质、细胞骨架、细胞分裂周期物质[6].本研究中，间接免疫荧光法检测ANA结果显示，女性患者ANA阳性率明显高于男性患者（χ2=16.55,犘<0.01），这与国内报导自身免疫性疾病以女性多见基本相符[4,7].本研究中，间接免疫荧光法检测ANA荧光模型分布与邓学新等[8]的报道均存在一定的差异，可能是因为接受调查人群不同的原因；另一方面目前ANA的检测还没有一个较为统一的质量控制体系[9.10],各实验室由于使用的荧光显微镜、检测试剂盒、检测人员的操作和结果判断经验等差异，也是导致各实验室间结果差异的一个重要原因。　　本研究发现，间接免疫荧光法检出ANA阳性率明低于蛋白质印迹法（χ2=158.69,犘<0.01）。间接免疫荧光法检测ANA阳性标本中，有20例蛋白质印迹法检测为阴性，可能是因为蛋白质印迹法没有包被相应特异性抗原而无法检出。蛋白质印迹法检测ANA为阳性的775例标本中，有295例间接免疫荧光法检测为阴性（38.06%），提示间接免疫荧光检测ANA可能存在假阴性的可能性，因而选择一个敏感性较高的检测组合显得得十分必要。本研究发现，几乎每一种特异性ANA阳性的标本都或多或少有间接免疫荧光法检测阴性的结果，其中以抗CENPB抗体出现阴性的情况最高，其次是抗Jo.1抗体、抗PM.SCL抗体，抗PCNA抗体、抗AMAM2抗体、抗SCL.70抗体，国内邓学新等[8]、吴庆等[11]、魏方等[12]也有类似报道。　　本研究发现，间接免疫荧光法检测ANA的荧光模型与特异性ANA之间没有绝对的规律可言，尽管荧光模型具有一定的提示作用，但一种自身抗体可以出现不同的荧光模型，不同的自身抗体可以出现不同的荧光模型，仅依靠荧光模型很难推断特异性ANA的种类。蛋白质印迹法所使用的包被抗原必须是纯化的抗原，才能保证被测定抗原的准确性和特异性，但目前许多自身抗体的确切抗原尚不明确，许多抗原不易被纯化，故仅有少部分抗原有纯化的产品能用于特异性检测[2];另外，一条检测膜条也很难做到包被所有特异性抗原，膜条检测项目的增加引起的成本增加，也会相应加重患者负担，因此，临床应根据患者的实际情况选择针对性的初筛试验与确认试验检测组合，在保证实验质量的情况下尽量减少患者的负担。自身免疫性疾病的诊断除依赖于临床症状、体征及相应辅助检查外，很大程度取决于免疫学诊断，特别是自身抗体的检测结果，目前新的自身抗体还在不断涌现，各种新的检测方法被用于自身抗体的检测，这些变化一方面为医务工作者提供了更多的选择和诊断指标，另一方面也带来困惑，如何根据患者的病情选择针对性的自身抗体的检测组合十分必要。检验工作者应在了解各种测定方法的特性情况下尽量向临床宣传解释有关自身抗体及各种技术在临床检测的价值与优缺点，为临床合理地选择自身抗体及检测方法提供帮助。　　参考文献　　[1]叶应妩，王毓三，申子瑜，等。全国临床检验操作规程[M].南京：东南大学出版社，2006:655.662.　　[2]王兰兰。自身抗体检测的应用与质量保障原则[J].中华检验医学杂志，2005,10（28）：987.990.　　[3]仇宁，陈志强。抗核抗体和特异性自身抗体检测的临床应用[J].国外医学皮肤性病学分册，2001,4（27）：229.231.　　[4]赵辨。临床皮肤病学[M].3版。南京：江办科学技术出版社，2001:648.704.　　[5]周厚清，董敏，马路。ANA、抗抗ds.DNA抗体和ENA多肽抗体与自身免疫性疾病的关系[J].中国卫生检验杂志，2008,12（18）：2675.2676.　　[6]王兰兰。临床免疫学及免疫检验[M].3版。北京：人民卫生出版社，2003:190.199.　　[7]赖永才，毛炜。自身免疫性疾病中抗核抗体与抗ENA抗体的相关性分析[J].检验医学与临床，2011,4（8）：815.816.　　[8]邓学新，曲昌华。818例自身免疫性疾病抗ENA抗体与抗核抗体的对照分析[J].临床检验杂志，2005,4（23）：302.303.　　[9]彭晓东，王兰兰，张瑞薇，等。抗核抗体荧光免疫检测质量控制方法的建立和应用[J].中华检验医学杂志，2004,3（27）：190.192.　　[10]肖艳群，陈慧英，叶萍，等。上海地区自身抗体检测质量现状调查分析[J].检验医学，2008,5（23）：298.300.　　[11]吴庆。抗可提取性核抗原抗体与抗核抗体的对照分析[J].国际检验医学杂志，2006,8（27）：679.680.　　[12]魏方。抗核抗体与抗ENA抗体的相关性分析[J].实验与检验医学，2009,2（27）：61.62.　　（收稿日期：2013.12.15）