曲尼斯特对大鼠放射性肺损伤的干预作用

作者               作者单位

聪颖      温州医学院附属第一医院，浙江 温州 325000

张薛榜    温州医学院附属第一医院，浙江 温州 325000

吴式琇    温州医学院附属第一医院，浙江 温州 325000

李凡凡    温州医学院附属第一医院，浙江 温州 325000

官静      温州医学院附属第一医院，浙江 温州 325000

Effect of Tranilast on Radiation-Induced Lung Injury in Rats

XIE Cong-ying, ZHANG Xue-bang, WU Shi-xiu, et al.

(The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, China)

Abstract: [Purpose] To investigate the effect of Tranilast on expressions of TGF-β1, type Ⅰ and Ⅲ collagen induced by radiation lung injury in rats. [Methods] Sixty-five Wistar rats were divided into 3 groups: irradiation and Tranilast treatment group (experimental group), 25 rats; irradiation alone group, 25 rats; and control group, 15 rats. Level of TGF-β1 in plasm was detected at different time points. Expression of TGF-β1, typeⅠand Ⅲ collagen was detected immunohistochemically. Morphological characteristics in right pulmonary were observed microscopically. [Results] Compared to irradiation alone group, the appearance of alveolitis and fibrosis was delayed and mild, and TGF-β1 expression was significantly lower in 2 months after irradiation in experimental group (P=0.002). TypeⅠcollagen (3 months after irradiation) and Ⅲ collagen deposition(2 months after irradiation) in experimental group significantly decreased compared with irradiation alone group(P=0.001). The peak of TGF-β1 in plasm was delayed until the third month after radiation in experimental group. [Conclusion] Tranilast alleviates radiation-induced lung injury via down-regulating TGF-β1 expression, as well as reducing biosynthesis of type I and Ⅲ collagens. It suggests that Tranilast is provided with therapeutic potential as an antifibrotic agent.

Key words: Tranilast; radiation-induced lung injury;therapy

放射性肺损伤是胸部肿瘤放射治疗的常见并发症，临床上有效治疗措施少，疗效不满意，严重影响患者的预后和生活质量。糖皮质激素为首选药物，但其不良反应及禁忌证较多，如何寻找新型的低毒、高效且价廉的药物有很大意义。曲尼斯特(Tranilast)是一种常用的抗过敏药物，有报道其可抑制胶原蛋白的联合，抑制转化生长因子(TGF-β)的表达。本实验旨在通过观察曲尼斯特对放射性肺损伤模型大鼠的转化生长因子-β1(TGF-β1)及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组与药物

成年Wistar雌性大鼠65只，体重200±20g ，8周龄，由温州医学院实验动物中心提供，4～6只1笼，饲料、饮水不限。分为3组，即单纯照射组(以下简称单照组)25只，曲尼斯特治疗照射组(以下简称实验组)25只和空白对照组(以下简称空白组)15只。实验组曲尼斯特(Tranilast)于放射治疗前2周开始给药，采用灌胃给药，给药剂量50mg/kg，持续到照射后2个月。空白组与单照组均灌以等体积的生理盐水。

1.2 照射方法

经腹腔注射2%氯胺酮(100mg/kg)麻醉后，固定于自制的固定装置上，采用美国Varian公司2300C/D直线加速器产生的6MV-X线，剂量率600cGy/min，照射面积为3.0cm×5.0cm，采用半野技术，行大鼠右全胸照射，照射剂量为单次20Gy。

1.3 标本制备

于照射后0.5、1、2、3、6、9个月分别取大鼠尾静脉血浆标本行TGF-β1检测，实验组与单照组每个时间点脱颈椎法处死4只大鼠，空白组每时间点处死2只大鼠，剪开胸腔取出大鼠右肺组织，右肺中叶固定于4%甲醛液做石蜡切片，行常规光镜形态学观察及免疫组化检测。

1.4 组织学观察

常规HE染色，光镜下观察组织病理学改变。

1.5 免疫组化检测

TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的免疫组化试剂盒均购自武汉博士德公司，一抗为大鼠IgG，二抗为生物素化山羊抗大鼠IgG，按试剂盒说明书操作。采用链霉亲和素—过氧化物酶法(SABC)检测肺内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及TGF-β1的表达，用美国Image-Pro Plus 专业图像软件分析系统进行数据采集和定量分析，检测其吸光度(A)值。对各组大鼠肺脏切片随机选取10个视野测量，计算阳性染色面积占肺脏视野面积比，并进行定量分析，以染色面积在标本中所占百分比表示。

1.6 血浆TGF-β1检测

取大鼠尾静脉100~150μl血浆标本用于TGF-β1水平的检测，TGF-β1的检测用武汉博士德公司的试剂盒和ELISA方法进行。操作按说明书进行。

1.7 统计学处理

采用SPSS 12.0统计软件包计算，多组间数据比较用单因素方差分析，组间两样本均数的比较行LSD检验。

2 结 果

2.1 光镜下组织病理学改变

各观察时间点，空白组大鼠肺组织均未出现明显病变。

单照组肺泡炎和纤维化出现早且程度重：照射后1个月即可见间质增厚、肺泡腔内纤维素样渗出;照射后2个月可见局部肺实变和代偿性肺气肿;照射后6个月，肺泡壁重度增厚，肺泡腔明显变小;照射后9个月可见局部肺泡壁被胶原组织代替。

曲尼斯特组肺泡炎出现晚且程度轻：照射后2个月见轻度间质增厚，少量纤维素样物渗出，无肺实变;照射后3个月间质仍未见明显胶原纤维;照射后6个月仅见微小灶肺实变;照射后9个月，局部肺泡壁见胶原组织，但纤维化范围较单照组明显减少。

2.2 免疫组化检测结果

2.2.1 TGF-β1表达情况

TGF-β1表达在支气管上皮细胞，肺泡巨噬细胞，肺泡上皮细胞，血管平滑肌细胞以及成纤维细胞的细胞质中，呈棕褐色颗粒。组间比较显示：单照组在照射后半个月即明显上升(P=0.001)，至第2个月达高峰，各实验点的表达均明显高于空白组(P<0.05)。实验组的TGF-β1表达水平比单照组降低，在照射后2个月，实验组比单照组下降(P=0.002)。见表1。

2.2.2 Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达

Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白呈网状或条索状，主要分布在细支气管上皮下组织，肺间质及血管平滑肌中。单照组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达水平逐渐增强。组间比较显示实验组的表达水平明显低于单照组，Ⅲ型胶原蛋白从照射后2个月开始、Ⅰ型胶原蛋白从照射后3个月开始，下降与单照组比较有统计学差异(P=0.001)。见表2、3。

2.3 血浆TGF-β1结果

单照组血浆TGF-β1含量在照射后1个月开始增加，高峰在照射后第2个月，以后逐渐回落至一偏高水平。实验组的TGF-β1含量高峰延至照射后第3个月，且明显低于单照组。实验组与单照组的TGF-β1含量均高于对照组，与肺损伤的程度一致。见表4。

3 讨 论

放射性肺损伤(包括放射性肺炎和肺纤维化)的发生是一个由多种细胞因子启动和维持的胶原蛋白代谢调控失衡的结果。其中TGF-β1是放射致肺损伤过程中最重要的细胞因子，它可趋化炎症细胞、成纤维细胞，促进细胞合成IL-1、TNF-α，同时还调节细胞外基质(ECM)包括Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成增加，减少ECM的降解[1~4]。本研究显示，单照组无论是血浆TGF-β1含量还是肺组织TGF-β1表达在各实验点均明显高于空白组(P<0.05)，肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达水平在单照组亦比空白组明显升高，提示TGF-β1的增高和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的失衡在放射性肺损伤发生、发展过程中起重要作用。

糖皮质激素为放射性肺损伤治疗的首选药物，但其不良反应及禁忌证较多，限制了临床应用。曲尼斯特(Tranilast)是一种常用的抗过敏药物，长期应用毒性较低。已有实验研究揭示该药对不同种类纤维化疾病具有治疗和预防作用[5，6]，其药理作用主要是通过抑制转化生长因子β(TGF-β) 的表达阻抑成纤维细胞的生长，从而抑制胶原成分的表达[7]。Suzawa 等[8]给背部种植人瘢痕瘤成纤维细胞的裸鼠口服曲尼斯特，与去炎松对照，结果曲尼斯特可抑制TGF-β释放，从而抑制胶原合成，但不会对健康皮肤的胶原合成造成不良影响。而去炎松对皮损处及正常皮肤成纤维细胞的胶原合成均有抑制作用，提示曲尼斯特这种抑制作用具特异性，作用机制不同于皮质类固醇。曲尼斯特在放射性肺纤维化中应用尚未见研究。本实验用曲尼斯特干预放射性肺损伤，因其起效较慢，故于照射前2周提早给药。观察结果显示光镜下曲尼斯特组肺泡炎及纤维化比单照组出现晚且程度明显减轻，仅在照射后6个月见微小灶肺实变;免疫组化显示曲尼斯特组在照射后明显抑制了TGF-β1的表达以及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达。推测曲尼斯特可能通过抑制TGF-β1的表达而减少Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的沉积，达到减轻放射性肺损伤的目的。综上提示，该药是除糖皮质激素外治疗放射性肺损伤的又一选择。

【参考文献】

[1] Rube CE, Uthe D, Schmid KW, et al. Dose-dependent induction of transforming growth factor beta(TGF-beta) in the lung tissue of fibrosisprone mice after thoracic irradiation[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2000, 47(2):1033-1042.

[2] Molina V, Blank M, Shoenfeld Y, et al. Fibrotic disease[J]. Harefuah, 2002, 141(11):973-978,1009.

[3] Pardo A, Selman M. Molecular mechanisms of pulmonary fibrosis[J]. Front Biosci,2002, 7(1):1743-1761.

[4] Am J. Inflammatory mechanisms are not a minor component of the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Respir Crit Care Med, 2002, 165(9):1206-1207.

[5] 陈连军, 项蕾红, 祝禄川, 等. 曲尼斯特对人正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞部分细胞因子表达的影响[J].临床皮肤科杂志, 2006, 35(8):497-499.

[6] 方志成, 王玮, 周昌娥, 等. 曲尼斯特对心肌梗死后心肌间质纤维化的影响[J]. 心脏杂志, 2006, 18(3):326-328.

[7] Ikeda H, Inao M, Fujiwara K. Inhibitory effect of tranilast on activation and transforming growth factor beta 1 expression in cultured rat stellate cells[J]. Bioochem Biphys Res Commun, 1996, 227(2):322-327.

[8] Suzawa H, Kikuchi S, Arai N, et al. The mechanism involved in the inhibitory action of tranilast on collagen biosynthesis of keloid fibroblasts[J]. J Jpn J Pharmacol, 1992, 69(2):912-961.