探讨鼠胚实验中两种精子处理方法对实验结果影响

　　小鼠精子采集，是生殖工程和受精机制研究方面最基本的重要技术，其优劣直接影响到受精率或其他与精子相关的研究。例如质量控制实验———鼠胚实验(mouseembryoassay，MEA)是目前最常用于生殖中心实验室培养液、耗材和设备质量控制的生物方法，适用于新建或新启动周期的常规体外受精(IVF)实验室质量控制[1]。国内有报道，采用常规处理法进行鼠胚实验，其受精率、卵裂率及囊胚形成率比国外其他中心报道的要低[2]。因此，本研究分别采用常规处理法[3-9]和单密度梯度离心法[3-9]进行处理，并通过观察和比较两种方法对实验结果的影响，探讨建立适合鼠胚实验的精子处理方法。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验材料　实验动物SPF级昆明小白鼠购自广东省医学实验动物中心[合格证号：SCXK(粤)2008-0002]。雌鼠6～8周，体质量25～30g;雄鼠6～8周，体质量30～40g。小鼠促排卵药物注射用尿促性素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)购于宁波第二激素厂。主要培养液采用瑞典VitrolifeG5Series序贯培养液：卵-胚胎处理液、受精-培养液、卵裂胚培养液、囊胚培养液、超纯培养油等。除取卵-胚胎处理液使用前1d置37℃培养箱孵育外，其他培养液均于使用前1d配制好置37℃、6%CO2培养箱平衡过夜。主要耗材及设备：培养皿、试管、移液管等均为美国Falcon公司产品，CO2气体纯度为99.999%，德国LabotectC200二氧化碳培养箱，美国Thermo3111二氧化碳培养箱。

　　1.2　实验方法

　　1.2.1　小鼠超排卵[10]和鼠卵采集　晚上20：00点每只雌鼠腹腔内注射PMSG10IU，48h后腹腔内再注射HCG10IU，第2天早上9：00点(注射HCG后13h)以颈椎脱臼法处死雌鼠，无菌条件下取出输卵管，放入盛有卵-胚胎处理液的培养皿中，用眼科镊刺破输卵管膨大部，将卵丘团收集到250μL受精-培养液内，每滴一团卵子，置37℃、6%CO2培养箱孵育。

　　1.2.2　精子处理

　　1.2.2.1　常规处理法　以颈椎脱臼法处死雄鼠，取附睾尾和输精管放入1mL受精-培养液中，用注射器把附睾尾划开几个小口，用钟表镊挤出精子，置37℃、6%CO2培养箱孵育60min。

　　1.2.2.2　单密度梯度离心法　加入1mL80%密度梯度离心液在锥形离心管的底部，在其液面上小心加入1mL的精子标本，150×g离心20min;去上清，加入1mL受精-培养液，混匀，300×g离心8min;去上清，加入适量受精-培养液混匀，调整浓度至约40×106/mL，置37℃、6%CO2培养箱孵育45min。

　　1.2.3　体外受精　在显微镜下观察其活力及浓度，吸取精子悬液到含有卵子的培养液滴中，使终浓度为(1～2.5)×106/mL[1]，置37℃、6%CO2培养箱中孵育，6h后将卵子“捞起”。在卵裂胚培养液中吹洗3次，转至新的已平衡好的卵裂胚培养液内，置37℃、6%CO2培养箱继续培养。

　　1.2.4　原核及卵裂期胚胎的观察与培养　D0：卵子受精6h后“捞起”并剥除颗粒细胞，观察是否有原核或双极体，并将其转入已平衡好的卵裂胚培养液中继续培养;D1：2细胞期鼠胚观察;D2：4细胞期鼠胚观察;D3：桑葚期鼠胚观察，并转入已平衡好的囊胚培养液中继续培养;D4～5：囊胚期鼠胚的观察。

　　1.3　统计学处理　采用SPSS13.0软件进行统计学分析，计数资料以率表示，采用χ 2检验，以p<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结　　果

　　2.1　两种方法处理后的受精率比较　采用单密度梯度离心法处理的精子与小鼠卵母细胞IVF后获得的受精率为96.2%，常规处理法为55.1%，二者比较差异有统计学意义(p<0.01)。

　　2.2　两种方法处理后的卵裂率比较　采用单密度梯度离心法处理的精子与小鼠卵母细胞IVF后获得的卵裂率为97.7%，常规处理法为84.5%，二者比较差异有统计学意义(p<0.01)。

　　2.3　两种方法处理后的囊胚形成率比较　采用单密度梯度离心法处理的精子与小鼠卵母细胞IVF后获得胚胎继续进行培养的囊胚形成率为86.8%，常规处理法为56.8%，二者比较差异有统计学意义(p<0.01)。

　　3　讨　　论在小鼠IVF的影响因素中，精子的浓度、活力对实验结果影响很大[11]。本研究采用两种精子处理方法处理小鼠精子，行IVF时的精子终浓度均在(1～2.5)×106/mL[10]。但实验数据显示，采用单密度梯度离心法处理的受精率明显高于常规处理法，极有可能是因为单密度梯度处理后的精子存活率高，活力好，同时去除了大部分的细胞碎片和死亡精子等杂质，精子质量大为提高。本实验结果和Bath[12]的观点一致，即去除不动精子、附睾精子碎片和聚集成团的精子，能提高小鼠体外受精率。本研究中两种方法处理后的精子与鼠卵共孵育时间均采用6h[10，13]，且因胚胎在不同发育时期对营养物质的需求和代谢不同[14]，所以胚胎培养均采用序贯培养法进行。但实验数据显示，采用单密度梯度离心法处理精子的卵裂率、囊胚形成率明显高于常规处理法。原因可能是采用常规处理法处理的精子含有大量的死精子、细胞碎片及杂质，常规IVF过程中长时间精卵共孵育会产生大量的活性氧，使卵细胞处于一个不良的培养环境中，所形成的受精卵发育潜能差，导致卵裂率和囊胚形成率明显低于单密度梯度离心法。本研究数据提示，采用单密度梯度离心法处理后的精子活力高、杂质少，形成的胚胎具有较好的发育潜能，卵裂率和囊胚形成率显著提高。综上所述，昆明小鼠鼠胚实验采用单密度梯度离心法处理后行常规体外受精，受精率、卵裂率及囊胚形成率比采用常规处理法高，其中囊胚形成率达到国内相关标准[15-17]。因此该精子处理方法适用于鼠胚实验中。

　　参考文献

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　　(收稿日期：2013-11-01)