特发性膜性肾病患者尿中足细胞与蛋白尿的相关性分析

　　作者：尚瑜1,尹爱萍2　　作者单位：1. 西安医学院临床医学院内科学教研室，陕西西安　710021;2. 西安交通大学医学院第一附属医院肾病中心，陕西西安

　　【摘要】目的探讨特发性膜性肾病患者尿足细胞与尿蛋白之间的关系。方法选取40例特发性膜性肾病患者及30例健康人，采用独立样本t检验法比较试验组与健康对照组尿中足细胞的数、收缩压、舒张压、血清白蛋白、24 h尿蛋白量，并将试验组各项指标与尿足细胞作相关性分析，寻找与尿足细胞相关的因素。结果　实验组患者尿足细胞数、尿蛋白水平明显高于健康对照组。Pearson相关分析显示试验组患者尿足细胞数与24 h尿蛋白量呈负相关，而与血压、血清白蛋白等指标无相关性。直线回归分析显示尿足细胞数和24 h尿蛋白量呈直线关系。结论　特发性膜性肾病患者尿足细胞数较正常人升高，尿足细胞与24h尿蛋白量有一定的关系，尿足细胞数随着尿蛋白量的增加而减少。

　　【关键词】 特发性膜性肾病,足细胞,蛋白尿

　　ABSTRACT： Objective　To explore the correlation between urinary podocytes and urinary protein in patients with idiopathic membranous nephropathy (IMN). Methods　Totally 40 patients with IMN and another 30 healthy people were recruited. Independent sample t testing method was adopted to compare the test and control groups in terms of the number of urinary podocytes， diastolic blood pressure， systolic blood pressure， serum albumin and 24 h urine protein amount. The correlation of all the indicators from the test group with urinary podocytes was analyzed to look for the factors related to urinary podocytes. Results　The number of urinary podocytes was apparently larger in the test group than in the control group. Pearson correlation analysis showed that the number of urinary podocytes in the test group was negatively correlated with 24 h urinary protein amount， but it had no correlation with such indicators as blood pressure and serum albumin. Linear regression indicated that the number of urinary podocytes had a linear relation with urinary protein amount. Conclusion　The number of urinary podocytes in patients with idiopathic membranous nephropathy is larger than that in non-patient population. The number of urinary podocytes is associated with 24 h urine protein amount， and it is negatively correlated with urinary protein amount.

　　KEY WORDS： idiopathic membranous nephropathy; urinary podocyte; proteinuria

　　特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy， IMN)以肾小球脏层上皮细胞(podocytes)下免疫复合物弥漫性沉积、基底膜(glomerular basement membrane， GBM)增厚伴钉突形成为病理特征。成人中多发，男性多于女性。常表现为肾病综合征(nephrology snydrome， NS)。其病程进展缓慢，通常持续蛋白尿多年，肾功能才逐渐恶化，对治疗不敏感，约1/3最终进入肾功不全[1]。自从Heymann制作出膜性肾病动物模型至今已50年，有关IMN的致病机制研究取得了较大进展。从最初Heymann肾炎抗原糖蛋白gp330(megalin)的提出[2]，到人类IMN足细胞表面抗原中性内肽酶(neutral endopepdase， NEP)的阐明[3]，再到近期IMN患者血循环中M型磷脂酶A2受体(phospholipase A receptor， PLA2R)抗体的发现[4]，IMN致病机制有了重大的突破。根据目前对IMN发病机制的认识，IMN是抗足细胞抗体介导的自身免疫性肾脏病，其上皮下免疫复合物形成导致的补体活化、足细胞损伤是IMN大量蛋白尿产生的原因。大多数观点认为是由于循环抗体与足细胞表面的受体相关蛋白结合，形成上皮下原位免疫复合物，激活补体形成C5b-9膜攻击复合物，继而刺激肾小球上皮细胞(足细胞)产生细胞外基质，如Ⅳ型胶原等，导致肾小球基底膜的弥漫性增厚，并诱导连接基底膜与肾小球上皮细胞的黏附分子功能的改变，使肾小球滤过膜出现缺陷，从而导致蛋白尿产生[5]。所以说足细胞的激活与损伤是原发性膜性肾病发生、发展的关键。本文通过相关性分析了解膜性肾病的蛋白尿、血清白蛋白和血压等因素与尿足细胞的相关性，从而探讨原发性膜性肾病患者尿足细胞与尿蛋白之间的关系，为进一步探索原发性膜性肾病的发病机制做铺垫。

　　1　资料与方法

　　1.1　资料来源

　　选择2006年1月至2008年12月在西安交通大学医学院第一附属医院肾脏内科住院的患者，经肾穿刺术获取的组织标本用HE染色、PAS染色、Masson染色和免疫荧光染色方法确诊为IMN的患者，共40例。诊断过程中排除以下继发性IMN：①结缔组织病引起的膜性肾病(membranous nephropathy， MN)，如狼疮性肾炎、类风湿关节炎相关MN;②乙型肝炎病毒相关性肾炎;③丙型肝炎病毒相关性肾炎;④过敏性紫癜性肾炎;⑤新生物所致MN，如肺癌、乳腺癌、胃肠道及肾脏肿瘤引起的MN;⑥药物所致MN，如金制剂、汞、青毒胺、非固醇类消炎药等;⑦IgA肾病中的膜性病变型。另选同一时期的30例健康体检者作为对照组。

　　1.2　观察指标

　　每位患者入院后、肾穿前某日(一般为肾穿前2 d)24 h避免剧烈运动，经12 h空腹过夜，晨起卧位测量右上臂收缩压(systolic blood pressure， SBP)和舒张压(diastolic blood pressure， DBP)，留取晨尿100 mL检测尿中足细胞，抽静脉血5 mL用离心机以2 000 r/min的速度离心15 min，分离出血清后测定白蛋白(albumin， ALB)。检查当日晨起第一次排尿后开始收集24 h尿液，至第2天清晨第一次排尿算在内，记录总尿量，以20 mL甲苯防腐，搅拌均匀后取5 mL样品检测尿蛋白浓度，乘以总尿量计算24 h尿蛋白。30例健康人以同样方法留取标本检测各观察指标。

　　1.3　尿足细胞的检测

　　①制做切片。取清洁中段晨尿标本100 mL，以1 800 r/min的转速离心5 min，弃上清液，将剩余的尿沉渣混匀，取沉渣每孔50 μL置自动涂片离心机(SHANDON，cat NO 740)中，以1 200 r/min的转速离心2 min，取出玻片室温下干燥，然后用丙酮在4 ℃下固定10 min，自然干燥。②免疫荧光染色。将上述待染标本的载玻片以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)轻洗2次湿润，置10 g/L TritonX-100后5 min,10 mL/L牛血清ALB(BSA)封闭，室温30 min，滴加小鼠抗人Podocalyxin单克隆抗体(购自美国Santa Cruz公司)体积比1∶20稀释，4 ℃过夜，FITC荧光标记山羊抗小鼠IgG(中山生物技术公司)体积比1∶75稀释，37 ℃孵育30 min，碘化丙啶(美国Sigma公司)染核，甘油封片，荧光显微镜下观察。③观察方法。荧光显微镜(Nikon OPTIPHOT-2)下双盲法观察，由2位本文作者在荧光显微镜下共同观察，每份标本低倍镜视野观察全片，高倍镜下确认小鼠抗人Podocalyxin单克隆抗体标记阳性足细胞。然后选择全片左上、左下、右上、右下和中间5个不同部位10个高倍视野，记录完整足细胞数。

　　1.4　统计学分析

　　结果以x-±s表示，所有数据录入SPSS 16.0统计软件，采用回归分析和方差分析，P<0.05为具有统计学意义。

　　2　结　　果

　　2.1　实验组与对照组年龄、性别的构成差异

　　实验组患者40例，年龄15～71岁，平均(41.3±13.8)岁。其中男性25例，平均年龄(42.3±16.5)岁。女性15例，平均年龄(39.7±8.0)岁。对照组30名健康体检者，年龄18～74岁，平均(40.9±16.2)岁。其中男性18例，平均年龄(43.5±16.5)岁。女性12例，平均年龄(37.5±15.7)岁。用四格表卡方检验法比较2组的性别构成，结果χ2=0.045(P>0.05)，故认为2组性别的构成差异无统计学意义(表1)。表1　实验组和对照组性别构成的比较表2　实验组和对照组年龄构成的比较

　　2.2　实验组和对照组各项临床指标的比较

　　实验组和对照组间各观察指标的比较采用两独立样本t检验法(表3)。结果显示年龄t=-0.19(P>0.05)，SBP t=0.92(P>0.05)，DBP t=-0.67(P>0.05)，故2组研究对象的年龄、SBP和DBP差异无统计学意义。其他观察指标如足细胞t=15.7(P<0.01)，ALB t=-12.0(P<0.01)，尿蛋白t=10.5(P<0.01)差异均有统计学意义，即实验组患者尿足细胞数、尿蛋白量水平明显高于对照组，而血清ALB水平明显低于对照组。表3　实验组与对照组各项临床指标的比较

　　2.3　实验组患者各项临床指标与尿足细胞的相关性

　　对试验组所测数据进行正态性检验(正态概率纸检验)，符合正态分布，绘制出尿足细胞的累加概率图(图1)也支持标准化残差呈正态分布。可以进行相关性分析。图1　尿足细胞的累加概率图将试验组患者年龄、SBP、DBP、ALB、尿蛋白等指标分别与尿足细胞数做Pearson相关性分析(表4)。尿蛋白Pearson系数=-0.351(P=0.027<0.05)，有统计学意义，其余指标P值均大于0.05，提示这些指标与尿足细胞无相关性。故IMN患者尿足细胞与尿蛋白呈负相关。表4　各项临床指标与尿足细胞的Pearson相关分析

　　2.4　尿足细胞与尿蛋白的回归分析

　　以尿足细胞为因变量，尿蛋白为自变量做直线回归分析，结果显示相关系数R=0.351，决定系数R2=0.123，调整决定系数=0.100，剩余标准差=3.137。说明尿足细胞变化的因素中10% 可归因于尿蛋白的变化。以尿蛋白为自变量，尿足细胞为因变量绘制成散点图(图2)，从图中可以看出尿足细胞数和尿蛋白大致呈直线趋势。图2　尿足细胞与尿蛋白的散点图　直线回归经方差分析得出F=5.324，P=0.027<0.05，直线回归系数t检验，t=-2.307，P=0.027<0.05，与方差分析一致。便可认为因变量(足细胞)和自变量(尿蛋白)间有直线关系。回归分析中常数项=10.159，回归系数=-0.441。因此，所建立的回归方程为Y=10.159-0.441X。

　　3　讨　　论

　　蛋白尿是肾小球疾病最常见的临床表现，过去一直认为蛋白尿不仅仅反映肾小球损伤，而且可以促进系膜细胞增生，导致系膜硬化;引起上皮细胞损害，肾小球毛细血管内微血栓的形成，促进了肾小球的硬化。还可引起肾小管上皮细胞的损伤，并与小管间质纤维化的发生和发展密切相关。许多研究显示，蛋白尿的程度与终末期肾病发展速度相关，即经过肾小球毛细血管屏障漏出的蛋白质，具有肾毒性作用，其本身就成为慢性肾脏病进展，发展为终末期肾病的独立危险因素。肾小球基底膜通透性的变化导致蛋白尿，蛋白尿是肾小球滤过屏障损伤的标志。各种肾小球疾病无论是大量蛋白尿还是微量蛋白尿，都是由于肾小球滤过屏障受损引起，但其受损的机制可能不尽相同。在疾病状态下，足细胞也是肾小球疾病炎症与非炎症损伤的靶位[6-9]。本研究结果显示，在IMN患者中，尿足细胞数与尿蛋白的量呈负相关，其内在机制尚不清楚。理论上讲，尿足细胞数代表了肾小球足细胞的损伤程度，尿足细胞数越多则脱落的足细胞越多，肾小球滤过屏障的损伤就越大，尿蛋白量也应该越多[10-12]。但是，本研究的结果与之刚好相反。分析其原因可能是IMN患者肾脏病理改变以GBM下免疫复合物沉积，GBM增厚和结构改变为主，足细胞的脱落不能反映其滤过屏障的损伤程度。此外，也有可能是因为尿蛋白量多的患者容易形成蛋白管型，尿足细胞被包埋于管型中导致荧光着色显著减弱，在荧光镜下不易被发现，造成假阴性结果。而且当肾脏病理改变越重时，滤过膜的损伤就越严重，尿蛋白量就越大;同时膜性肾病的病理分期与肾小球病变的发展时间有关。如前面所述，病变时间越长，肾组织中可脱落的足细胞数越少，尿中足细胞数越少，故二者负相关。其他一些研究发现与上述结果不同。例如，张敏等[13]对30例DN患者的研究发现尿足细胞数与尿蛋白量无显著相关。VANDEN等[14]对成年慢性肾小球肾炎患者的研究也发现尿足细胞数与尿蛋白量无相关性。分析原因可能是与DN和慢性肾小球肾炎相比，足细胞在IMN患者蛋白尿发生机制中所起的作用不同。

　　总之，本文对40例IMN患者进行了尿足细胞的检测，发现所有患者尿中有足细胞排出，实验组尿足细胞数与尿蛋白量的多少有密切的关系，可以用尿足细胞这一项无创检查来进行膜性肾病病情的追踪观察。

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