局部免疫法治疗重型斑秃的疗效及作用机制分析

　　作者：巩毓刚,赵莹,张小婷,叶艳婷,杨建,章星　　作者单位：中山大学附属第一医院 皮肤性病科

　　【摘要】 【目的】 分析局部免疫法治疗中国重型斑秃患者的疗效及探讨其作用机制?【方法】 对63例斑秃患者进行二苯环丙烯酮局部免疫治疗?治疗前进行皮肤镜?实验室?病理检查,治疗过程中对血常规?总IgE进行监测并复查部分患者头皮病理?同时检测21名患者治疗前后血清细胞因子浓度,并征集正常对照13人,年龄性别与斑秃组相匹配?【结果】 本组患者总有效率为61.0%,疗效仅与脱发面积成负相关,即面积越小,疗效越好,而与其它临床资料无相关关系?相比有效组,严重不良反应组治疗前血清IgE浓度较高?经治疗后真皮浅层血管周围单个核细胞浸润明显增多?患者血清Th1型细胞因子IFN-γ?IL-12在治疗前较正常对照高,经治疗后有效组明显降低,与正常对照无差异,而无效组IFN-γ未降低,IL-12水平反而较治疗前升高?Th2 型细胞因子IL-4在无效组治疗前后均高于正常组,IL-10均低于正常组,而在有效组该两种因子治疗前与正常无差异,治疗后升高,且高于正常水平?【结论】 局部免疫法可用于治疗重型斑秃,疗效较确切,且相对较安全?治疗前进行IgE测定可初步预示治疗过程中炎症反应过强者,而IL-4升高可能提示对局部免疫疗法无效?治疗后有效组Th1 型细胞因子的表达减少,恢复了原有Th1 与Th2细胞因子的平衡状态,使毛囊从休止期重新进入生长期,达到毛发生长的治疗效果?

　　【关键词】 斑秃;局部免疫疗法;细胞因子;Th1与Th2

　　Abstract:【Objective】 To investigate the therapeutic effect of topical immunotherapy in Chinese severe alopecia areata (AA) patients and to explore the mechanism.【Methods】 Detailed clinical data in 63 patients of severe AA enrolled in this study were recorded. Laboratory blood tests, serum IgE level, scalp tissue biopsies were carried out pre- and post-treatment. In the course of treatment, global photographic views and dermoscopic features were analyzed to monitor the process of hair growth. Cytokine levels were measured in 13 healthy controls and 21 patients pre- and post-treatment. 【Results】 The respond rate to treatment was 61.0%. Effectiveness of treatment did not correlate with any of clinical features, except that it correlated negatively with hair loss area. Pre-treatment serum IgE level was significantly higher in adverse-effects group than in responders group. Compared with pre-treatment, perivascular mononuclear cell infiltration in superficial dermis was significantly increased after treatment. It was also noted that, prior to treatment, alopecic patients had a remarkably higher serum level of Th1 cytokine such as IFN-γ and IL-12 when compared to healthy controls. Post-treatment levels of IFN-γ and IL-12 were significantly decreased, but levels of IL-4 and IL-10 were increased in the responder group, different from that in the non-responder group. In the non-responder group after treatment, IFN-γ level was not significantly decreased and an increase of IL-12 level was even found as compared to pre-treatment levels. Also, serum level of IL-4 was higher and IL-10 was lower than normal controls both pre- and post-treatment. 【Conclusion】 Topical immunotherapy treatment is an effective way to treat severe AA patients and it is relatively safe. Pre-treatment serum IgE level can be used as a prognostic marker of treatment intolerance. Also, high level of IL-4 at pre-treatment may be a valuable indicator for non-responder. Mechanism of action can be interpreted as restoration of the immunological balance by decreasing Th1 cytokine levels and increasing Th2 cytokine levels. Thus, the newly formed cytokine milieu is crucial in promoting entry of hair follicles into anagen stage which results in hair regrowth.

　　Key words: alopecia areata; topical immunotherapy; cytokine; Th1 and Th2

　　慢性化脓性中耳炎是中耳黏膜?骨膜或深达骨质的慢性化脓性炎症?由于该病的病程较长,各种致病菌有可能复杂多变;而且多年抗生素的广泛应用,尤其是不规范的应用可能会使致病菌及其对抗生素的敏感性产生一定的变异?本课题组从2008年1月到2010年12月3年期间对369耳在我院住院治疗的慢性化脓性中耳炎进行微生物分析,找出常见的感染细菌分布,对药物敏感性及最小抑菌浓度(MIC, minimum inhibitory concentration)等进行分析,并和本课题组之前的研究[1]进行比较分析,以期动态地对慢性中耳炎的细菌学和药物敏感性进行追踪分析,为临床合理应用抗生素提供更全面可靠的依据?

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　慢性化脓性中耳炎369耳,男212耳?女157耳,年龄9个月~77岁,中位年龄35岁?病程5个月~50年,平均12年以上?369耳慢性中耳炎的临床分型:非胆脂瘤型199耳?胆脂瘤型170耳?根据术前颞骨CT和术中所见患耳骨质破坏程度进行分度[2]:369耳慢性化脓性中耳炎中,由于患者其它系统疾病的原因,17耳未行手术治疗;10耳为二次手术,无法对骨质破坏进行评估;无骨质破坏的有73耳?89耳骨质轻度破坏?110耳骨质中度破坏?70耳骨质重度破坏?

　　1.2 研究方法

　　在普通照明和额镜下,以体积分数为75%的酒精清洁外耳道皮肤,用灭菌耳科转眼棉签沾湿灭菌生理盐水后,取鼓室内脓液,按无菌操作规范置入培养试管内,30 min内送细菌室做细菌培养及药物敏感试验?药敏试验采用WHO 推荐的MIC法,选用的药物参照抗生素敏感性实验的国际指南[3-4]?

　　1.3 统计方法

　　应用Excel表格方式将各数据输入?将致病菌的检出率进行排序,计算常见细菌的药物敏感度,并对各组别(敏感?中介?耐药)的MIC值及相应的细菌株数进行统计,用敏感率表达各抗生素的MIC值及其对应的抑菌程度?另外,为了和本课题组在2002年4月至2005年4月3年期间同类研究结果做比较,我们选用了已发表文章的部分数据[1]?

　　2 结 果

　　2.1 微生物的种类?所感染耳数及相关临床特点

　　369耳中培养有微生物生长254耳,检出率为68.83%?其中细菌231耳(占90.94%)?真菌23耳(9.06%),其中1例患者同时检出细菌和真菌?细菌检出率依次为:凝固酶阴性葡萄球菌71耳(占30.74%),铜绿假单胞菌53耳(占22.94%),金黄色葡萄球菌44耳(占19.05%),奇异变形杆菌12耳(占5.19%)?少数为摩根摩根菌摩根亚种?肺炎克雷伯菌?鲍曼不动杆菌?木糖氧化无色杆菌?大肠埃希菌?链球菌?粪产碱菌粪亚种?科泽柠檬酸杆菌?洋葱伯克霍尔德菌?阴沟肠杆菌等15种细菌?在凝固酶阴性葡萄球菌中,表皮葡萄球菌8耳?耳葡萄球菌和头状葡萄球菌各5耳?路邓葡萄球菌3耳?溶血葡萄球菌和山羊葡萄球菌各2耳?人葡萄球菌人亚种和沃氏葡萄菌各1耳,其余44耳未被鉴别出具体菌种?细菌感染中,134耳为革兰阳性菌(占58.01%),以凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌为主;97耳为革兰阴性菌(占41.99%),以铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌为主?

　　常见细菌与慢性化脓性中耳炎临床分型及骨质破坏之间的关系见表1,可见在胆脂瘤型中耳炎中,以奇异变形杆菌和铜绿假单胞菌感染为主;而在非胆脂瘤型中耳炎中,以凝固酶阴性葡萄球菌为主;金黄色葡萄球菌在两型中各占一半?在骨质破坏程度上看,绿脓杆菌感染耳以中或重度骨质破坏为主;凝固酶阴性葡萄球菌感染耳中33.8%都没有骨质破坏的;金黄色葡萄球菌和奇异变形杆菌感染耳的骨质破坏以轻度和中度为主?

　　真菌检出率依次为:在23耳真菌中,近平滑假丝酵母菌8耳;黑曲霉菌?黄曲霉菌和西弗假丝酵母菌各3耳;光滑假丝酵母菌和烟曲霉各2耳;杨巢曲菌和朗必可假丝酵母菌各1耳?从真菌检出谱可知检出真菌均为条件致病菌,且在相应的病理组织内均未找到真菌菌丝?

　　2.2 药物敏感试验

　　选择最常见的四种细菌进行药物敏感试验,药物包括青霉素类?头孢菌素类?喹诺酮类?大环内酯类?氨基糖甙类等,结果见表2和表3?表2中可见铜绿假单胞菌对药物的敏感率由高到低依次为:哌拉西林/他唑巴坦(100.0%),左氧氟沙星?庆大霉素?妥布霉素和亚胺培南(均为98.1%),头孢他啶(96.2%),头孢吡肟(92.5%),环丙沙星(90.5%),头孢唑啉(22.6%),氨苄西林/舒巴坦?头孢曲松和复方新诺明敏感率为0%?在敏感率为90%以上的药物中再分析MIC值和抑菌率,环丙沙星在MIC≤0.25 μg/mL时抑制75%的菌株,当浓度达到0.5 μg/mL时则抑制91.7%的菌株;妥布霉素在MIC≤1 μg/mL时已能抑制94.2%的菌株;庆大霉素在MIC≤1 μg/mL时抑制63.5%的菌株;哌拉西林在浓度为8 μg/mL时才能抑制90.0%的菌株?但奇异变形杆菌对上述14种实验药物都有较高的敏感度?

　　表3中显示凝固酶阴性葡萄球菌对药物的敏感率由高到低依次为:对喹努普汀/达福普汀?替考拉宁和万古霉素的敏感度均为100.0%;莫西沙星为93.2%;庆大霉素和利福平均为90.9%;其次为复方新诺明?克林霉素?环丙沙星?氨苄西林和红霉素;而苯唑西林?氨苄西林和青霉素G的耐药率都极高?在敏感率为90%以上的药物中再分析MIC值和抑菌率,替考拉宁在4 μg/mL时抑菌才达90.9%;万古霉素在2 μg/mL时抑菌93.2%;菌株喹努普汀在MIC≤0.25 μg/mL时就抑制88.6%的菌株,浓度为1 μg/mL时抑菌达97.7%;莫西沙星在MIC≤0.25 μg/mL时抑菌75%的菌株,浓度为0.5 μg/mL时抑菌达90.9%?金黄葡萄球菌对药物的敏感度由高到低依次为:对莫西沙星?喹努普汀/达福普汀?替考拉宁和万古霉素的敏感度均为100.0%;庆大霉素和环丙沙星均为90.9%;其次为复方新诺明?氨苄西林?利福平和苯唑西林;青霉素G的耐药率达95.5%?在敏感率为90%以上的药物中再分析MIC值和抑菌率,环丙沙星?莫西沙星和喹努普汀在MIC≤0.25 μg/mL?替考拉宁和万古霉素在MIC≤1 μg/mL时就能抑制90%以上的菌株?

　　将表2和表3的内容和以往研究的结果(表4和表5)相比,发现虽然相隔6年,但4种常见致病菌的药物敏感度变化不大:奇异变形杆菌依然对大多数的实验药物敏感(敏感率仍为100%)?哌拉西林/他唑巴坦?亚胺培南和头孢他啶对绿假单胞菌仍有较高的敏感率(90%以上);头孢吡肟?氨曲南和环丙沙星则保持80%以上的敏感率;但头孢曲松和复方新诺明对它的耐药性明显增加,近3年耐药率已高达100%?凝固酶阴性葡萄球菌和金黄葡萄球菌对替考拉宁和万古霉素的敏感度仍为100.0%;喹诺酮类抗生素对凝固酶阴性葡萄球菌的和金黄葡萄球菌的敏感率仍较高?

　　3 讨 论

　　本研究再次证实慢性化脓性中耳炎的常见致病菌依然是凝固酶阴性葡萄球菌?铜绿假单胞菌?金黄色葡萄球菌和奇异变形杆菌为主[1],这和过往别的学者关于慢性化脓性中耳炎的细菌学研究报道[1,5,7]基本上是相吻合的?与本课题组6年前研究相比[1],发现了慢性化脓性中耳炎致病菌的一些新趋势:①微生物的检出率逐年下降?本研究组在2002-2005年对317住院患耳病原学检查,微生物检出率是94.95%;而近3年对369住院患耳的检查中,微生物检出率只有68.83%?②虽然细菌学检查显示常见致病菌是同样4种细菌,但检出率和原来有些差异?原来的检出率依次为凝固酶阴性葡萄球菌?金黄色葡萄球菌?铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌;现在是凝固酶阴性葡萄球菌?铜绿假单胞菌?金黄色葡萄球菌和奇异变形杆菌,铜绿假单胞菌排行至第2位?③强致病菌检出率逐年下降,而微弱致病菌检出率逐年上升?本次研究中,4种常见的致病菌只占检出细菌的66.23%,而6年前的研究提示4种常见细菌的检出率为76.4%;本次研究检出了多种微弱致病菌,例如摩根摩根菌摩根亚种?木糖氧化无色杆菌?科泽柠檬酸杆菌?洋葱伯克霍尔德菌?阴沟肠杆菌?粘质沙雷菌?假鼻疽伯克霍尔德菌等?④真菌检出率有较大增长?真菌的检出率由原来的2.66%增加到9.06%,且以条件致病菌为主,没发现强致病真菌?究其原因,可能是:①慢性中耳炎的病程很长,中耳病变由最初的致病菌感染引起过度到后来炎症因子所带动的骨质破坏为主;抗生素的长期使用;当然也不能排除取材的因素?抗生素的长期使用一方面使到致病菌的检出率减少;一方面使到一些易于耐药的强致病菌,例如铜绿假单胞菌的感染率增高?②慢性化脓性中耳炎患者外耳道深部温暖湿润,适宜真菌生长;广谱抗生素和肾上腺皮质激素等的应用;特别是局部抗生素的应用使耳真菌的感染率有较大的提高?由于这种真菌感染是继发性的,因此以条件致病菌为主?③结核病?糖尿病等一些消耗性疾病的发病率升高,使一些弱致病菌引起机会性感染增多?

　　本研究对常见细菌与慢性化脓性中耳炎临床分型及骨质破坏之间的关系做了初步分析,发现在中耳胆脂瘤中,以奇异变形杆菌和铜绿假单胞菌感染为主,这与阿不都如苏力近期在新疆地区做的研究相吻合[8],这可能与它们的生存及致病机理有关?铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌均为条件致病菌,其分泌的外毒素是重要的致病性物质?正常健康者的完整皮肤是天然屏障,活力较高的毒素亦不能引起病变,但在病程较长的慢性化脓性中耳炎患者中,尤其是胆脂瘤患者一般都有局部皮肤或者骨质的破坏;另外中耳?外耳道环境潮湿;长期不规范的抗生素使用,这些都增加了这两种机会致病菌感染的机会,而条件致病菌感染和胆脂瘤的破坏两者相互影响,又加重了病变的进程?关于细菌感染的种类与慢性中耳炎骨质破坏程度的研究报道极少,我们发现绿脓杆菌感染耳中骨质破坏以中或重度为主,凝固酶阴性葡萄球菌感染耳骨质破坏相对较轻?究其原因,考虑可能有两方面的因素:绿脓杆菌作为一个强致病菌通过炎症反应使组织结构的损伤较重;另一个更为主要的原因可能是它所引起的连锁免疫应答反应?我们以往的一些研究发现IL-17和IFN-γ和在中耳胆脂瘤中的表达量是上调的,且与骨质破坏的程度正相关[9]?IL-17?IFN-γ分别是Th17?Th1的标志性细胞因子,它们在机体免疫应答中起到关键作用,具有多种免疫活性,不仅可以作为强大的前炎症因子激活局部的炎症反应,更重要的是它们还可以直接或间接地调节破骨细胞的生成而影响骨质吸收,因此我们推测绿脓杆菌刺激多种炎症因子间接地调节破骨细胞的生成而影响骨质吸收?当然,这些细菌与胆脂瘤造成骨吸收的关系还有待于深入探讨?

　　药敏实验对正确的临床用药有指导意义?近3年与2002-2005年期间的药物敏感试验相比,四种常见致病菌的药物敏感度基本相似?本次研究再次证实环丙沙星和莫西沙星对上述四种致病菌都较敏感,这和国内[1,5]和国外[10]较多的研究相吻合?在进一步的最小抑菌浓度和相应抑制细菌株数的研究中显示环丙沙星和莫西沙星的浓度在0.5 μg/mL时已对上述四种细菌有90%以上的抑菌作用,几乎是试验药物中MIC值最低的?另外,本研究中发现铜绿假单胞菌和变形杆菌在胆脂瘤型中耳炎中的感染比例最高, 这可能与其易形成生物膜有关[11],有研究报道有生物膜的假单胞菌/变形杆菌比无生物膜细菌耐药率高,但有生物膜菌种对喹诺酮类?第3代头孢菌素和泰能均敏感[12]?虽然喹努普汀/达福普汀?替考拉宁?万古霉素?泰能和亚胺培南对四种细菌的敏感度极高,但在临床治疗中,它们均为特殊使用药物,且价格昂贵?以莫西沙星为代表的喹诺酮类药物抗菌谱广?抗菌后效应长?药物动力特性好,在呼吸道黏膜的浓度高于血浆浓度,且耳毒性低[13]?因此,在没有药敏试验的情况下,对慢性化脓性中耳炎,特别是中耳胆脂瘤患者选择环丙沙星和莫西沙星等喹诺酮类抗生素是比较有效的,但同时我们也要注意到喹诺酮类抗生素的一些不良反应,要合理有效地应用这类抗生素[14]?

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