来氟米特对类风湿关节炎患者Th17细胞免疫调节的影响

　　作者：郑东海1,李晶1,吴玲1,尤海燕2　　作者单位：(江苏大学附属医院1.风湿免疫科，2.医学检验科，江苏 镇江 212001)

　　【摘要】 目的： 探讨来氟米特活性代谢产物A771726对类风湿关节炎(RA)患者外周血Th17细胞的影响及意义。方法： 取RA患者外周血单个核细胞(PBMC)，采用免疫磁珠法阴选出CD4+T辅助细胞(helper T cell， Th)，将CD4+T细胞分别与不同剂量的A771726(15、30、60 μg/ml)和地塞米松(10-6、10-7、10-8mol/L)共培养48 h，流式细胞术(FCM)检测RA患者外周血Th17/Th百分比;应用实时荧光定量逆转录聚合酶链技术(即RT-PCR)检测IL-17、ROR-γt mRNA水平。结果： 在体外，来氟米特对RA患者外周血CD4+ T细胞胞内IL-17、ROR-γt mRNA 表达无明显抑制作用，地塞米松可以使CD4+ T细胞胞内IL-17、ROR-γt mRNA 表达明显减少，随着药物浓度的增加抑制作用更加明显。来氟米特对Th17/Th无明显影响，地塞米松能降低Th17/Th细胞百分比。结论： 来氟米特对RA患者外周血Th17细胞无明显影响作用，而地塞米松则可显著降低Th17细胞在Th细胞中的比例。

　　【关键词】 类风湿关节炎; 地塞米松; 来氟米特; A771726; IL-17; ROR-γt

　　[Abstract]　Objective： To investigate the effect and significance of A771726 (activated metabolite of leflunomide) and dexamethasone on the expression of Th17 cells in patients with rheumatoid arthritis(RA). Methods： Isolatating CD4+T cells from PBMC by magnetic cell separator and then cultured with A771726 (concentration respectively as 15,30,60 μg/ml) or dexamethasone (concentration respectively as 10-6,10-7,10-8mol/L) for 48 hours. Determination of the percentage of Th17/Th by flow cytometry. The expression level of IL-17 and ROR-γt mRNA was determined by RT-PCR. Results： There was no obvious effect of leflunomide on intracellular IL-17 or ROR-γt mRNA of CD4+ T cells. The expression level of intracellular IL-17 and ROR-γt mRNA on CD4+ T cells were reduced by dexamethasone and these effect were more obvious with the increase of drug concentration. Leflunomide had no obvious effect on the percentage of Th17 cells， but dexamethasone could decrease the percentage of Th17 cells. Conclusion： Leflunomide had no obvious effect on Th17 cells， but dexamethasone could evidently decrease the percentage of Th17 cells.

　　[Key words]　rheumatoid arthritis;dexamethasone;leflunomide; A771726;IL-17;ROR-γt

　　类风湿关节炎(RA)是以对称性外周多关节病变为主要表现的自身免疫性疾病，其发病机制与T辅助细胞17(Th17)有密切的关系。Th17主要分泌IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)和IL-6，以分泌IL-17为特征，孤核受体(ROR-γt)是其特异性转录调控因子。本研究分别予不同浓度的来氟米特活性代谢产物A771726和地塞米松干预RA患者外周血CD4+T细胞，通过流式细胞术检测Th17/Th比例及 RT-PCR检测IL-17、ROR-γt mRNA水平，探讨这两种药物对类风湿关节炎患者外周血Th17细胞的影响，进一步了解来氟米特和地塞米松的作用机制。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料和仪器

　　CD4+T细胞免疫磁珠阴选试剂盒购自Dynal公司;RT-PCR试剂盒购于TaKaRa公司;莫能霉素(monensin，Mon)、地塞米松、佛波酯(PMA)、离子霉素(Ion)、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)购自Sigma公司;A771726由苏州长征欣凯公司惠赠;PE标记的抗人IL-17荧光抗体及重组人IL-23因子购自EBioscience公司;RPMI 1640、胎牛血清购自Gibco公司;固定与透膜试剂盒购自Invitrogen公司;淋巴细胞分离液(Ficoll)购自上海试剂二厂;荧光定量PCR仪MX3000P为TraTagene公司产品;FACS Calibur流式细胞仪为BD公司产品;实验所用引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2　对象及分组

　　受试者均为2010年6月至2011年6月期间来我科住院的初发类风湿关节炎患者，平均年龄(45±8)岁。经DAS28疾病活动度评分选轻度活动至重度活动患者共60例作为入选者。将每个患者外周血所分选的CD4+T细胞分7组：对照组(无药物干预组);3个组别的 A771726干预(干预浓度分别为15,30,60 μg/ml);3个组为地塞米松干预(浓度分别为10-6,10-7,10-8 mol/L)。

　　1.3　方法

　　1.3.1　分离培养外周血辅助性T淋巴细胞

　　取患者肝素抗凝静脉血10 ml，Ficoll法分离PBMC后，免疫磁珠法阴选出CD4+T细胞，纯度在90%以上。用含10%FBS的1640培养液重悬细胞后，以每孔2×105个细胞接种于96孔培养板中，加入PHA(终浓度为10 μg/ml)，根据实验分组分别向各孔中加入不同药物进行干预，将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h。

　　1.3.2　FCM检测Th17细胞百分比

　　培养细胞48 h后分别向各孔中加入离子霉素(终浓度为0.5 μg/ml)，佛波酯(终浓度50 ng/ml)及阻断剂莫能霉素，再培养4.5 h后，每孔收集100 μl细胞悬液放入流式管;加入固定剂A 100 μl，反应15 min;加入PBS 2 ml离心弃上清，再加入透膜剂B 100 μl反应5 min后，加入PE标记的抗人IL-17各10 μl,18～25℃避光反应30 min， PBS洗涤2次，弃去上清，加入预冷300 μl PBS重悬细胞，进行流式细胞仪测定，CellQuest软件分析Th17细胞比例。

　　1.3.3　RT-PCR检测 CD4+T细胞IL-17、ROR-γt mRNA水平

　　收集经不同浓度A771726和地塞米松干预48 h后的细胞，使用Trizol法抽提RNA，并逆转录获得cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR Green I嵌合荧光法进行定量PCR，按SYBR Premix Ex Taq?试剂盒要求建立PCR反应体系(总体积20 μl)，在MX3000P定量PCR仪上进行扩增。实验所用mRNA引物设计序列见表1。表1　β-肌动蛋白，IL-17和ROR-γt的引物序列

　　1.4　统计学处理

　　应用SPSS 16统计软件进行分析。计量数据以均数±标准差表示，不同组间的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　A771726及地塞米松对Th17细胞数的影响

　　当A771726浓度分别为15,30,60 μg/ml时Th17/Th比值分别为(1.53±0.24)%，(1.56±0.28)%，(1.47±0.22)%，药物干预组与对照组[(1.49±0.24)%]相比，Th17/Th比率无明显变化(F=0.860，P>0.05)，不同剂量来氟米特干预组组间比较，结果亦无统计学意义(P>0.05)，显示A771726对CD4+T淋巴细胞中Th17细胞比例无明显影响。当地塞米松浓度分别为10-8,10-7,10-6 mol/L时，Th17/Th分别为 (1.36±0.23)%，(1.20±0.29)%，(0.81±0.22)%，与对照组[(1.49±0.24)%]相比，Th17/Th百分比值有明显下降(F=56.382，P<0.01)。不同剂量地塞米松干预组组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)，显示地塞米松可以显著降低Th17细胞在外周血CD4+ T细胞中的百分比。

　　2.2　A771726及地塞米松对CD4+ T细胞中IL-17 mRNA及ROR-γt mRNA表达的影响

　　与对照组相比，经3种不同浓度A771726干预后，各组IL-17 mRNA及ROR-γt mRNA表达量无明显变化(P>0.05)，说明A771726对IL-17 mRNA及ROR-γt mRNA表达量无明显影响(图1)。与对照组相比，经3种不同浓度地塞米松干预后，IL-17 mRNA及ROR-γt mRNA表达量均下降(P<0.01)，且不同浓度地塞米松干预组组间比较，两种因子的mRNA表达量的差异均有统计学意义(P<0.01，图2)。图1　A771726对CD4+T细胞IL-17、ROR-γt mRNA表达的影响　　　图2　地塞米松对CD4+T细胞IL-17 mRNA、ROR-γt mRNA表达的影响

　　3　讨论

　　Th17细胞是近几年新发现的并且研究较多的T辅助细胞，在体内免疫调控过程中起着重要的作用[1-2]。目前认为Th17细胞及其分泌的细胞因子在包括RA，系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中发挥重要的作用[1,3]。来氟米特和地塞米松能改善自身免疫病病情及预后，是临床治疗自身免疫性疾病的重要药物[4]。

　　本实验通过地塞米松干预RA患者外周血CD4+ T细胞，发现地塞米松对Th17细胞有明显抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制作用明显增强。但其作用机制不十分明确。已知地塞米松可以进入胞质后与细胞内的GC受体结合，进入细胞核，抑制核因子-κB及活化蛋白-1，从而下调编码包括IL-17细胞因子基因，干扰IL-17 mRNA等基因转录，降低IL-17细胞因子的水平[5]。已知IL-17使滑膜成纤维细胞和软骨细胞基质金属蛋白酶的表达上调，促进破骨细胞祖细胞向成熟破骨细胞分化，提高胶原酶和软骨基质侵袭酶活性，促进软骨蛋白多糖和胶原降解，导致关节破坏[6]。本实验结果显示地塞米松可以通过对Th17细胞的抑制，改善RA患者的病情，达到临床治疗作用，但是有无其他的作用途径有待进一步探讨。

　　来氟米特是一种免疫抑制剂，用于RA等多种自身免疫性疾病的治疗[7]，我们采用来氟米特活性代谢产物A771726干预RA外周血CD4+T细胞后，发现IL-17、ROR-γt mRNA 表达无明显变化，提示A771726对Th17细胞无明显抑制作用，来氟米特可能通过Th1等其他途径发挥其免疫抑制作用[8]，有报道来氟米特对Th1细胞有明显抑制作用[9]，而Th1细胞在RA发病中占有重要地位，这为临床上将来氟米特用于治疗免疫性疾病提供了理论指导。

　　【参考文献】

　　[ 1 ] Park H， Li Z， Yang XO， et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin17[J]. Nat Immunol,2005,6(11)：1133-1141.

　　[ 2 ] Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，et al Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J]. Nat Immunol,2005,6(11)：1123-1132.

　　[ 3 ] Pernis AB. Th17 cells in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus[J]. J Intern Med,2009， 265(6)： 644-652.

　　[ 4 ] Van Roon EN， Hoekstra M， Tobi H，et al. Leflunomide in the treatment of rheumatoid arthritis. Ananalysis of predictors for treatment continuation[J]. Br J Clin Pharmacol,2005,60(3)： 319 325

　　[ 5 ] Buttgereit F， Straub RH， Wehling M，et al. Glucocorticoids in the treatment of rheumatic diseases： An update on the mechanisms of action[J]. Arthritis Rheum,2004,50(11)：3408-3417.

　　[ 6 ] Lubberts E， Joosten LA， van de Loo FA， et al. Reduction of interleukin-17-induced inhibition of chondrocyte proteogly can synthesis in intact murine articular cartilage by interleukin-4[J]. Arthritis Rheum， 2000， 43(6)：1300-1306.

　　[ 7 ] Kellner H， Bornholdt K，Hein G，et al. Leflunomide in the treatment of patients with early rheumatoid arthritis-results of a prospective non-interventional study[J].Clin Rheumatol,2010， 29(8)： 913-920.

　　[ 8 ] Wang HY， Cui TG， Hou FF， et al. Induction treatment of proliferative lupus nephritis with leflunomide combined with prednisone： a prospective multicentre observational study[J]. Lupus,2008,17(7)：638-644.

　　[ 9 ] Fukushima R，Kanamori S，Hirashiba M，et al. Inhibiting the teratogenicity of the immuno suppressant lefunomide in mice by supplementation of exogenous uridine[J].Toxicol Sci， 2009,108(2)： 419-426.