红斑狼疮皮损中淋巴细胞Bcl2表达的研究

　　作者：康瑞花,杨会钗,袁永贵,高顺强　　作者单位：050011 石家庄市，河北医科大学第四医院皮肤科(康瑞花、袁永贵、高顺强)，病理科(杨会钗)

　　【摘要】 目的检测红斑狼疮皮损区淋巴细胞Bcl2的表达情况。方法 采用免疫组织化学的方法对30例红斑狼疮皮损区淋巴细胞进行检测，并以17例正常皮肤作对照。结果 红斑狼疮患者皮损区淋巴细胞Bcl2表达程度明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 红斑狼疮皮损区Bcl2表达程度增强，可能会导致机体免疫功能紊乱而发病。

　　【关键词】 红斑狼疮 皮肤 Bcl 2 免疫组织化学

　　红斑狼疮发病原因不明，大量研究证明本病是一种自身免疫性疾病，细胞免疫功能异常可能参与了红斑狼疮的发病[1]。Bcl2及其代谢产物参与并调控淋巴细胞的凋亡，在淋巴细胞的克隆选择、免疫记忆和保持免疫系统的自身稳定方面具有重要作用。本研究采用免疫组化的方法对红斑狼疮皮损及正常皮肤中的Bcl2进行检测，旨在探讨红斑狼疮的发病机制，为红斑狼疮的治疗提供理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　选择2003年2月至2007年5月就诊于河北医科大学第四医院皮肤科门诊患者，结合临床表现，初步诊断为红斑狼疮，征得患者同意，于局麻下在皮损处用环钻取材，立即放入10%福尔马林溶液内固定6～8 h，石蜡包埋后备用。选取临床典型皮损结合组织病理确诊为红斑狼疮患者30例，其中男11例，女19例;年龄16～51岁,平均年龄(35±9)岁;病程2月～2年。所有患者近1月来未经治疗，也无其他并发疾病。分型：系统性红斑狼疮5例，盘状红斑狼疮20例，亚急性皮肤型红斑狼疮5例。正常对照组17例来自外科手术患者，男6例，女11例;年龄16～53岁,平均年龄(35±7)岁。2组患者在性别比、年龄方面差异无统计学意义(P>0.05)。

　　1.2 主要试剂及方法

　　(1)主要试剂：一抗鼠抗人Bcl2蛋白单克隆抗体工作液购于北京中杉金桥生物技术有限公司;链霉菌抗物素蛋白过氧化物酶连接法(SP)免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购于中山生物技术有限公司。(2)试验方法：采用免疫组化SP法，具体步骤为：石蜡标本常规5 μm连续切片，平铺于APES处理的载玻片上，37～42℃ 12 h烤干，二甲苯脱腊，梯度酒精入水，0.01 mmol/L PBS冲洗5min，共3次，3% H2O2室温孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，抗原热修复，滴加5%山羊血清孵育10 min阻断非特异染色，倾去血清，再依次滴加一抗工作液(Bcl2单克隆抗体)、二抗(抗兔、小鼠和大鼠IgG)、三抗(SP/HRP)，分别于37℃湿盒孵育2 h、1 h、1 h，以上每一步骤间以0.01 mmol/L PBS冲洗标本5 min，共3次，DAB显色，苏木精轻度复染，加拿大树胶封片。

　　1.3 结果判定标准

　　以细胞膜/浆染有棕黄色颗粒为阳性，选择淋巴细胞阳性表达最多处统计，根据阳性淋巴细胞百分数分为四级：阴性(-)：无阳性表达;弱阳性(+)：阳性细胞数10%;中度阳性(++)：阳性细胞数为11%～30%;强阳性(+++)：阳性细胞数>30%。

　　1.4 统计学分析

　　数据处理在SAS 8.0软件上进行，采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　Bcl2主要在淋巴细胞表达，皮脂腺、汗腺、毛囊及角质细胞偶有表达(如图1、2)。正常皮肤组织真皮散在淋巴细胞很少有Bcl2的阳性表达。红斑狼疮患者皮损淋巴细胞Bcl2表达程度明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。表1 淋巴细胞Bcl2表达结果例(略)注：与正常对照组比较，P<0.05

　　3 讨论

　　红斑狼疮发病原因不明，研究证明本病是一种自身免疫性疾病,免疫学特征是B细胞多克隆化，T细胞活化增加，产生较多的自身抗体[2]。正常情况下，机体对自身组织不产生免疫反应。正常机体内有完整的免疫系统，存在复杂的免疫调节功能，调节各种免疫活性细胞活动，控制免疫活性细胞突变和防止禁株免疫活性细胞复活，以阻止发生自身免疫[3]。研究发现自身反应性淋巴细胞通过细胞凋亡而清除，从而维持正常的自身耐受[4]。Bcl2及其代谢产物参与并调控淋巴细胞的凋亡，在淋巴细胞的克隆选择、免疫记忆和保持免疫系统的自身稳定方面具有重要作用[5]。Bcl2基因位于第18号染色体短臂21.3(18q21.3)[6]，Bcl2转基因鼠自身反应性B细胞呈多克隆化，产生过多的自身抗体，形成系统性红斑狼疮样病变[7]。Strasser等[8]研究发现Bcl2对成熟T细胞具有明显作用，表达Bcl2的外周血T细胞在培养中生存期和产生免疫应答持续时间均较长且免疫反应剧烈，这种变化可能是由于活化T细胞凋亡被抑制的结果。外周血淋巴细胞凋亡异常与系统性红斑狼疮的发病密切相关，而Bcl2是其主要凋亡控制基因,有研究发现活动期系统性红斑狼疮患者外周血CD+3、CD+4和CD+8 T细胞亚群Bcl2蛋白表达明显高于非活动期和正常对照组[9，10]。黄晓明等[11]采用PCR方法对系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞Bcl2基因的表达进行检测发现，红斑狼疮组Bcl2mRNA表达明显高于正常对照组。另有研究发现活动期系统性红斑狼疮患者外周血CD+3、CD+4和CD8 T细胞亚群Bcl2蛋白表达明显低于非活动期和正常对照组[12，13]。另有研究发现系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞Bcl2抗原表达正常[14，15]。为进一步探讨Bcl2在红斑狼疮发病中的作用，采用免疫组化的方法对红斑狼疮皮损中bcl2进行检测，发现Bcl2阳性淋巴细胞明显高于正常对照组，推测Bcl2的表达增强可能会导致T淋巴细胞凋亡异常，从而导致免疫紊乱而发病。

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