成人不同部位角质形成细胞的生物学特性比较

　　作者：韩军涛,王洪涛,胡大海,蔡维霞,汤朝武　　作者单位：第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科，陕西 西安 710033

　　【摘要】目的: 观察成人不同部位角质形成细胞的生物学差异，探讨用来构建自体组织工程皮肤的最佳表皮细胞来源. 方法: 体外分离培养成年男性头皮、躯干、下肢及包皮来源的角质形成细胞，分别利用绘制细胞生长曲线、3H胸腺嘧啶(3HTdR)掺入、流式细胞仪检测等方法比较细胞在生长增殖、细胞周期及代谢等方面的生物学差异. 结果: 在细胞的生长增殖及DNA合成代谢方面，头皮与包皮来源的角质形成细胞之间无统计学差异(P>0.05)，躯干与肢体来源的细胞之间亦无统计学差异(P>0.05)，但前两者均高于后两者(P<0.05);细胞周期分析表明，头皮及包皮来源的角质形成细胞S期比例高于躯干及肢体组. 结论: 头皮及包皮组织来源的角质形成细胞可作为构建自体组织工程皮肤的表皮细胞来源.

　　【关键词】 角质形成细胞;细胞培养

　　基金项目：陕西省社发攻关课题(2005K11G1);西京医院临床高新课题(XJGXA0517M15)

　　Biological characteristics of keratinocytes derived from different parts of the human skin

　　HAN JunTao, WANG HongTao, HU DaHai, CAI WeiXia, TANG ChaoWu

　　Department of Burns, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China

　　【Abstract】 AIM: To investigate the biological characteristics of keratinocytes derived from different parts of the human skin and discuss an optimal seed for the construction of tissue engineered skin. METHODS: The human keratinocytes were harvested from the different parts of human male skin such as foreskin, scalp, trunk and limbs (aged 25-35 years). The keratinocytes were cultured in KSFM serum free culture medium in vitro. The growth kinetic characteristics were studied by cell growth curve and the 3HTdR incorporation was employed to measure the DNA metabolism. The cell cycle was determined with flow cytometry. RESULTS: For the DNA metabolism and cell proliferation, there was no clear difference between scalp and foreskin groups (P>0.05). The same results were got from trunk and limbs groups (P>0.05). The difference was significant between the groups of scalp and foreskin and the groups of trunk and limbs (P<0.05). The percentage of cells in S phase of scalp and foreskin groups was much higher than that of trunk and limbs groups. CONCLUSION: It might be better to take the keratinocytes from scalp or foreskin as the seeding cells to construct the tissue engineered skin.

　　【Keywords】 keratinocytes; cell culture

　　0引言

　　大面积深度烧伤患者创面修复一直是烧伤治疗领域的难点，其原因主要是自体皮源严重不足. 虽然组织工程皮肤的出现为解决这一难题带来了希望，但到目前为止还没有任何一种组织工程皮肤能作为合适的皮肤覆盖物，以满足临床上严重烧伤患者的需求[1]. 我们设想利用患者自体来源的皮肤细胞，在体外快速扩增并构建组织工程皮肤，来完成对创面的修复. 在构建过程中，人体哪些部位来源的表皮细胞更适合于作为种子细胞，则是本研究想要探讨的问题.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　无血清培养液KSFM购自美国Gibco公司;Dispase酶及胰蛋白酶购自美国Sigma公司;MTT购自华美生物工程公司;550型酶标仪购自美国BioRad公司;流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司;3HTdR购自中科院原子能物理研究所. 头皮、躯干及肢体皮肤标本取自25～35岁男性烧伤患者(烧伤总面积≤30%，其中III度≤10%);包皮标本取自相同年龄段包皮环切术后. 所有标本均经患者及家属知情同意.

　　1.2方法

　　1.2.1HKC的分组及体外培养细胞按所取部位分为头皮(scalp)、躯干(trunk)、肢体(limbs)及包皮(foreskin)4组. 将所取标本剪成30 mm×5 mm皮条，置于2.5 g/L dispase酶中4℃消化过夜，剥离之表皮以0.01 mmol/L PBS冲洗3遍，再置于2.5 g/L胰蛋白酶与0.2 g/L EDTA混合液(体积比为1∶1)中，37℃消化5 min，终止消化后吹打、过滤、离心，收集细胞，用KSFM培养基重悬后调整细胞浓度为5×108/L，接种六孔板，每孔2 mL，每2～3 d更换培养液1次. 待细胞70%～80%融合时用上述混合消化液消化传代，比例为1∶2.

　　1.2.2观察指标

　　①细胞的生长增殖情况(四唑盐MTT比色法)：取第二代处于对数生长期细胞，同上消化细胞并收集后，以KSFM培养基重悬，调整细胞浓度为5×107/L，接种96孔板，每孔100 μL，每组2个复孔，37.0℃，50 mL/L CO2孵箱中孵育2 h后加入KSFM培养基300 μL/孔，继续培养24 h后将第一组细胞每孔加入20 mL MTT(20 g/L)，孵育4 h后弃上清，每孔加入0.5 mL二甲基亚砜，振荡30 min后选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定每个孔A值. 此后每天于相同时间点连续测量12 d并绘制细胞生长曲线. ②细胞的DNA合成代谢情况：取第二代处于对数生长期细胞，同上方法消化接种96孔板，细胞密度为1×104/孔. 接种24 h后换液并加入3HTdR 37 kBq/孔，继续培养24 h后弃培养基，加入2.5 g/L 胰蛋白酶200 μL/孔，37.0℃消化细胞5 min，吹打分散后加入等量100 g/L三氯醋酸，4℃过夜，用玻璃纤维滤膜收集细胞，无水乙醇干燥后烤干，于Beckman 6500 型闪烁仪上测定掺入率强度(cpm). ③细胞周期检测：各组均取第三代对数生长期细胞，同上方法消化收集细胞后，0.01 mmol/L PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1×109/L后，以700 mL/L的乙醇固定，进行细胞周期分析.

　　统计学处理：实验数据以x±s表示，以SPSS10.0 软件进行统计分析，采用方差分析及LSDt检验，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1HKC的生长增殖来自于头皮及包皮的角质形成细胞，其生长增殖明显快于躯干及肢体来源的角质形成细胞. 前两者又以头皮组较快，并于第10日达到平台期，躯干及肢体组的细胞在生长增殖方面无明显差别(图1).

　　2.2细胞的DNA合成头皮与包皮来源的角质形成细胞之间无统计学差异(P>0.05)，躯干与肢体组的细胞之间亦无统计学差异(P>0.05)，但前两者均高于后两者(P<0.05,图2).

　　2.3细胞周期头皮组及包皮组S期细胞比例高于躯干组(P<0.05, 表1).表1各组角质形成细胞的细胞周期分析(略)

　　3讨论

　　在烧伤的临床治疗中，自体皮移植仍然是解决深度创面修复的唯一途径. 但人体皮肤中可被用来作为供皮区的部位是有限的，一个大面积烧伤患者往往需要多次手术才能完成创面的封闭，这不仅使得治疗的周期大大延长，而且也常常使得患者有限的供皮区消耗殆尽，给患者后期继发畸形的整复带来极大的困难，部分患者因很难再有条件进行后期的治疗而导致终生残疾[2].

　　细胞生物学技术的出现为解决这一难题带来了一线希望. Rheinwald等[3]于1975年成功地对人体角质形成细胞进行了体外分离培养. 此后随着实验室技术的不断改进，其培养的稳定性得以大大提高. 在此基础上，该项技术被成功地用于烧伤创面的修复、供皮区修复和肢体溃疡的治疗等多方面[4-6]. 与此同时，该项技术在组织工程皮肤的构建方面也得到了极大的应用[7-8]. 但全身不同部位的角质形成细胞在生长增殖方面是否均处于同一个水平呢，此方面的研究尚鲜见报道.

　　我们选择成年男性不同部位的皮肤作为研究对象，对其角质形成细胞的生物学特性进行了相关研究, 结果表明，在细胞的生长增殖及DNA合成代谢方面，头皮与包皮来源的角质形成细胞之间无明显差异，而躯干组与肢体组之间亦无明显差异，但前两者不论在细胞的增殖方面还是DNA的合成方面均明显高于后两者;细胞周期分析结果也证实了这一点.因此，我们认为头皮及包皮组织来源的角质形成细胞可作为构建自体组织工程皮肤较理想的表皮细胞来源.

　　【参考文献】

　　[1]蔡霞,曹谊林,商庆新,等. 皮肤组织工程研究进展[J]. 中华实验外科杂,2001,18(3):287-288.

　　[2]陈璧，贾赤宇. 半个世纪以来我国烧伤创面修复的进展[J]. 中华烧伤杂志，2000，16(1)：8-10.

　　[3]Rheinwald JG, Green H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned Cell line derived from a teratoma[J]. Cell，1975，6：317-321.

　　[4]Yanaga H, Udoh Y, Yamauchi T, et al. Cry preserved cultured epidermal allografts achieved early closure of wounds and reduced scar formation in deep partial thickness burn wounds (DDB) and spit thickness skin donor sites of pediatric patients [J]. Burns, 2001, 27(7)：689-698.

　　[5]宓惠茹. 表皮细胞培养移植与烧伤创面修复[J]. 北京医学, 2002, 24(4): 203-205.

　　[6]邓天政, 金岩, 何黎升. 组织工程皮肤在皮肤缺损修复中的应用[J]. 国外医学生物医学工程分册,2005,28(2):116-117.

　　[7]吴国选,伍津津. 组织工程皮肤修复创面的研究进展[J]. 实用医药杂志, 2005,22(11):1038-1040.

　　[8]Currie LJ, Sharpe JR, Martin R. The use of fibrin glue in skin grafts and tissue engineered skin replacements: Review [J]. Plast Reconstr Surg, 2001，108(6)：1713-1726.