中性粒细胞淋球菌感染模型的建立

　　作者：陈嵘，陈 蕾，张国学，樊翌明，吴志华 作者单位：(广东医学院附属医院皮肤科，广东湛江　524001)

　　【摘要】 目的 研究诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及一氧化氮(NO)在中性粒细胞淋球菌感染模型中的表达。方法 分离正常人外周血中性粒细胞，在10%胎牛血清DMEM培养液上培养3 h，A组加入空白培养基，B组加入淋球菌菌液，随后在0、3、8、12 h分别以实时定量荧光PCR测定iNOS mRNA表达，用镉还原法检测NO浓度。结果 B组中iNOS mRNA表达和NO水平均较A组升高(P<0.01)，NO浓度在8 h达到高峰。结论 中性粒细胞淋球菌感染模型可成功模拟该菌体内微氧感染环境，可用于研究淋球菌致病机制。

　　【关键词】 淋球菌;中性粒细胞;一氧化氮

　　Establishment of gonococcusinduced neutrophil infection model

　　CHEN Rongyi, ZHANG Guoxue, CHEN Lei, FAN Yiming, WU Zhihua (Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)

　　Abstract:Objective To investigate the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nitric oxide (NO) in gonococcusinduced neutrophil infection model. Methods Peripheral blood neutrophils were islolated from health men, and then cultured in DMEM medium containing 10% fetal calf serum for 3 h. Blank medium or gonococcal inocula was added into group A or group B. NO concentration and iNOS mRNA expression at 0, 3, 8 and 12 h were determined by cadmium reduction method and realtime quantitative fluorescent PCR, respectively.Results Compared with group A, iNOS mRNA expression and NO level increased obviously in group B (P<0.01), and NO content peaked at 8 h.Conclusion The gonococcusinduced neutrophil infection model can simulate the microoxygen infection circumstance in vivo, and is suitable for studying the pathogenic mechanism of gonococcus.

　　Key words: gonococcus; neutrophil; nitric oxide

　　淋球菌为兼性厌氧的革兰阴性双球菌，可引起生殖系统急性化脓性炎症，脓性分泌物中存在大量中性粒细胞[1]。中性粒细胞是一种专职吞噬细胞，感染初期可在炎症介质的介导下聚集在病灶处，通过吞噬摄入致病菌[2]。中性粒细胞杀伤吞噬微生物的机制包括活性氧簇、抗菌蛋白、一氧化氮(NO)等[3]。尽管中性粒细胞在淋球菌感染初期可迅速聚集到病灶，但淋病的迁延不愈表明中性粒细胞引起的炎症反应不足以彻底清除淋球菌。中性粒细胞可杀灭大部分吞噬的细菌(如大肠杆菌)，但部分淋球菌可在中性粒细胞内生存甚至繁殖[45]。淋球菌是如何实现免疫逃逸并得以在中性粒细胞内生存的问题目前尚未完全阐明。本研究拟建立中性粒细胞淋球菌感染模型，观察NO和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，旨在将其用于研究淋球菌致病机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 淋球菌菌株

　　淋球菌株ST2951用WGC淋球菌专用培养基培养(购自中国科学院武汉生物制品研究所)制备成OD600值为0.15的细菌悬液。

　　1.2 外周血中性粒细胞的分离

　　6名健康成年男性分别抽取2 mL肝素抗凝静脉血，取抗凝血与Hank液混匀后小心加入到人中性粒细胞分离液中(天津灏洋生物制品科技有限公司，LTS1087)，18℃、2000 r/min离心20 min，待离心管由上至下分4层;吸取第3层(中性粒细胞)加入到含Hank液15 mL的试管中，充分混匀，2000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀反复洗涤2次，再用含10%胎牛血清DMEM培养液重新悬浮细胞(1×107/mL);充分混匀后滴入细胞培养板中，置5%CO2培养箱37℃培养3 h备用。取少量细胞液涂片，作台盼蓝拒染实验，鉴定其存活率。

　　1.3 中性粒细胞淋球菌感染模型的建立

　　取出培养板，A组每孔加入含10%胎牛血清DMEM 培养液150μL，B组每孔滴入淋球菌悬液150μL;加样完毕后继续孵育，按0、3、8、12 h时间点在培养孔中吸出培养液作相应检测，每组设3个复孔。

　　1.4 实时荧光定量PCR检测iNOS mRNA含量

　　用Trizol溶液(美国GIBCO公司)提取中性粒细胞总RNA，经紫外分光光度计检测符合纯度后逆转录为cDNA，再进行实时荧光定量PCR检测。根据GeneBank序列设计iNOS、βactin引物，序列见表1。反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性5 s，60℃退火10 s，72℃ 延伸20 s，共40个循环。应用SYBR GreenⅠ荧光染料(美国Biotium公司)技术行实时定量PCR反应，获取各组标本的标准曲线，计算机分析Ct值(每个反应管内荧光强度达到系统认为有目的DNA合成时的循环数，以阴性对照作参考)。表1 引物序列

　　1.5 NO浓度检测

　　收集细胞培养液-70℃保存，用镉还原法测定亚硝酸盐浓度。培养液以3000 r/min离心5 min，用NaOH和硫酸锌作蛋白沉淀处理，3000 r/min离心5min，取上清液1.5 mL依次加入0.08 mmol/L 甘氨酸NaOH缓冲液1.0 mL、活化镉3.0 g，摇匀后放置90 min;取1 mL加入新试管，依次加入1% 磺胺0.5 mL、0.1% N1萘基乙二胺盐酸0.5 mL，摇匀后静置20 min，用721分光光度计测OD值(λ=546 nm，灵敏度=1，空白调0)，根据该值计算亚硝酸盐浓度。

　　1.6 统计学处理

　　数据以(±s)表示，采用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析及q检验、t和t'检验。

　　2 结果

　　2.1 中性粒细胞中iNOS mRNA含量

　　实时荧光定量PCR显示：淋球菌刺激后B组中性粒细胞中iNOS mRNA含量均升高，而A组变化不明显(图1，表2);同一时间点相比，B组的iNOS mRNA表达显著高于A组(F=51.87，P<0.01)。

　　2.2 细胞培养液中NO水平

　　A组NO水平明显低于B组(P<0.01)。A组各时间点NO浓度差异无统计学意义(F=0.865,P>表2 两组NO与iNOS mRNA表达同一时间点两组间比较，*P<0.01;同组不同时间点间比较，#P<0.01。

　　0.05);B组不同时间点NO浓度差异有统计学意义(F=106.79,P<0.01)，8 h时最高(表2)。

　　2.3 iNOS mRNA与NO表达的关系

　　Spearman相关分析表明，B组中性粒细胞iNOS mRNA表达与细胞培养液中NO水平呈高度正相关(r=0.87，P<0.01)。

　　3 讨论

　　淋球菌侵犯黏膜单层柱状上皮细胞(如尿道、子宫颈)后，借助菌毛、蛋白Ⅱ、IgA1分解酶与细胞黏附，然后被吞饮进入细胞并大量繁殖，导致细胞损伤、裂解和死亡，释放出的淋球菌又可感染更多的黏膜上皮细胞。淋球菌感染时，LOS(lipooligosaccharide，脂寡糖)激活单核巨噬细胞，通过TLR4(模式识别受体)使NFκB转至细胞核内，导致炎性细胞因子的合成和释放[6]。IKB释放出活性成分P56、P60，其与DNA结合后促进炎症因子转录，如IL1β、TNFα、IL6、IL8、MHCⅡ、ICAMI、iNOS、COX2表达。IL1β、TNFα诱导多种黏附分子(VCAM1、ICAM1)表达，促进中性粒细胞黏附、渗出、趋化，引起化脓性炎症反应[2]。

　　中性粒细胞是抵抗淋球菌感染的主要炎症细胞，但淋球菌可通过某些机制逃逸免疫攻击。研究表明淋球菌可在中性粒细胞内生存甚至繁殖，这是引起淋病迁延不愈的原因。因此，有必要对淋球菌与中性粒细胞相互作用机制进行研究。我们将分离的正常人外周血中性粒细胞作体外培养，3 h后台盼蓝拒染实验显示中性粒细胞存活率达90%以上;培养的中性粒细胞中加入淋球菌悬液，孵育2h后可见淋球菌粘附于中性粒细胞表面或被吞入细胞内。用淋球菌刺激后，中性粒细胞iNOS mRNA表达和培养液中NO水平明显升高，8 h时NO浓度最高，iNOS与NO表达呈正相关;提示淋球菌感染可诱导中性粒细胞表达iNOS、合成NO。已有研究证实NO对炎症反应的作用依赖于其浓度改变，低浓度NO起抗炎作用，高浓度NO(如细菌脂多糖刺激iNOS所产生的NO)有促炎作用[7]。Householders等[8]通过对淋球菌norB基因的测定认为，淋球菌可产生和还原NO，并可通过控制NO产生来调节宿主的炎症反应，这种炎症调节机制将导致机体发生有症状或无症状感染。此外，Rock等[9]发现NO可诱导脑膜炎双球菌norB基因表达。

　　本研究成功建立了中性粒细胞淋球菌感染模型，可模拟体内微氧感染环境，为进一步阐明淋球菌致病机制提供了可靠的研究方法。我们将利用此模型了解淋球菌norB、aniA等基因表达情况，深入探讨淋球菌的免疫逃逸机制。

　　【参考文献】

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　　[3] Lorenzen D R, Günther D, Pandit J, et al. Neisseria gonorrhoeae porin modifies the oxidative burst of human professional phagocytes [J]. Infect Immun, 2000, 68(11): 62156222.

　　[4] Casey S G, Shafer W M, Spitznagel J K. Neisseria gonorrhoeae survives intraleukocytic oxygenindependent antimicrobial capacities of anaerobic and aerobic granulocytes in the presence of pyocin lethal for extracellular gonococci [J]. Infect Immun, 1986, 52(2): 384389.

　　[5] Rest R F, Fischer S H, Ingham Z Z, et al. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with human neutrophils: effects of serum and gonococcal opacity on phagocyte killing and chemiluminescence [J]. Infect Immun, 1982, 36(2): 737744.

　　[6] PalssonMcDermott E M, O'Neill L A. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Tolllike receptor4 [J]. Immunology, 2004, 113(2): 153162.

　　[7] Overton T W, Whitehead R, Li Y, et al. Coordinated regulation of the Neisseria gonorrhoeaetruncated denitrification pathway by the nitric oxidesensitive repressor, NsrR, and nitriteinsensitive NarQNarP [J]. J Biol Chem, 2006, 281(144): 3311533126.

　　[8] Householder T C, Fozo E M, Cardinale J A, et al. Gonococcal nitric oxide reductase is encoded by a single gene, norB, which is required for anaerobic growth and is induced by nitric oxide [J]. Infect Immun, 2000, 68(9): 52415246.

　　[9] Rock J D, Thomson M J, Read R C, et al. Regulation of denitrification genes in Neisseria meningitidis by nitric oxide and the repressor NsrR [J]. J Bacteriol, 2007, 189(3): 11381144.