朗格汉斯细胞在多形日光疹皮损中的表达及超微结构

　　作者：燕华玲 苏一平 郭新建 王 永 郭 砚 马文宇 蔺小倩 作者单位：青海大学附属医院

　　【摘要】 目的 探讨朗格汉斯细胞(Langerhans Cell, LC)在多形日光疹(polymorphic light eruption, PLE)发病中的作用及其与细胞免疫的关系。方法 应用免疫组织化学技术标记健康皮肤及PLE皮肤组织中LC的CD1a，观察两组组织中LC的数量、形态及分布;用透射电镜观察2例PLE患者皮损中LC的超微结构并和2例面颈部正常皮肤作比较，结果进行统计学分析。结果 PLE皮损中LC的数量较正常皮肤组织明显增多，树突变长且数量增多，而且其LC中Birbeck(BG)颗粒数量显著增多，粗面内质网扩张，部分粗面内质网核糖体颗粒脱落，高尔基复合体分泌旺盛。结论 LC在PLE的发病中起重要作用，在此过程中LC自身也受到不同程度的损害。

　　【关键词】 朗格汉斯细胞 多形日光疹 免疫组化

　　ULTRASTRUCTURE AND EXPRESSION OF

　　LANGERHANS CELL IN POLYMORPHIC

　　LIGHT ERUPTION LESIONS

　　Yan Hualing , Su Yiping,Guo Xinjian,Wang Yong, Guo Yan,

　　Ma Wenyu, Lin Xiaoqian

　　(Affiliated Hospital of QingHai University)

　　Abstract Objective To explore the effect of langerhans cell(langerhans cell, LC) and the relation between cellular immunity during the occurrence and development of polymorphic light eruption (PLE). Methods Cluster of differentiation 1a(CD1a) expression was detected by immunohistochemical method with PLE patients and healthy skins. Tow places of PLE lesion skin and normal skin derived from face and neck were detected by transmission electronic microscope. Results Amount of LC and the length of its dendrite in PLE lesions was markedly increased compared with controls, In LC of PLE lesions, the number of Birbeck granules increased and rough endoplasmic retieula(RER) distended, the ribosomes on the part of RER began to fall, And secretion of Golgi complexs can also be found. Conclusion LC plays an important role in the occurrence of PLE. Furthermore, the LC was injured itself at the same time.

　　Key words Langerhans cell Polymorphic light eruption Lmmunohistochemistry

　　多形日光疹(polymorphic light eruption，PLE)是一种与日光照射有关的光敏性皮肤病，本病确切病因不清，遗传、内分泌、微量元素和机体代谢改变、免疫机制变化等因素参与PLE发病[1]。

　　LC是表皮中重要的抗原呈递细胞，其功能是将抗原摄取、加工、处理并提呈给T细胞，活化的T细胞产生细胞因子并发挥一系列免疫效应。LC在电镜下可见胞浆内有棒状或球拍状的Birbeck颗粒，CD1a分子是其表面标记。我们通过免疫组化技术对23例PLE患者皮损中LC的表面标志CD1a分子进行检测，运用光镜、电镜观察其数量、形态、分布以及超微结构的变化，探讨LC在PLE发病中的作用及其与细胞免疫的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 资料

　　1.1.1 对象

　　选取青海大学附属医院皮肤科2007年10月～2008年10月经临床和组织病理确诊PLE患者23例，其中男16例，女7例，年龄15～64岁，平均48.62±12.68岁。取患者皮损组织用免疫组化方法检测皮损中分化群CD1a的表达水平。同时选取15名面颈部正常皮肤组织作为对照，对照组在年龄、性别及取材部位上与PLE患者组相匹配。透射电镜标本来源于其中的2例PLE患者，男1例，女1例,同时选取来源于青海大学附属医院口腔外科的2名面颈部正常者皮肤作为对照。

　　1.1.2 试剂

　　鼠抗人CD1a单克隆抗体、即用型免疫组化Elivision plus试剂盒、DAB显色液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组化Elivision plus法

　　操作按试剂盒步骤进行，所有切片染色均采用相同条件，实验设PBS代替一抗为阴性对照。正常皮肤组织为正常对照。

　　1.2.2 透射电镜( TEM)法

　　取材后将标本放置于PBS液配制的3%戊二醛固定液中2 h，PBS漂洗，10min×3 times;1%锇酸中固定2 h，PBS漂洗，10min×3 times;两次丙酮梯度脱水;行浸透、包埋、聚合，半薄切片染色，光镜定位;超薄切片，枸橼酸铅、醋酸铀双染，TEM观察。

　　1.2.3 结果判定与统计分析方法

　　将染色后的切片置于光镜下观察，细胞膜或细胞浆呈黄褐色的树枝状突起的细胞为CD1a阳性的LC，每张切片任意取LC分布最密集的5个区，在光镜(×40)的视野下计数CD1a阳性细胞的数目。以5个高倍视野下CD1a阳性细胞平均数为LC数目。此外，在CD1a染色中，每张切片在40倍的光镜视野中随机观察5个视野，计算平均每个高倍视野中的LC树突个数与LC数量的比值，作为此张切片平均每个LC的二维树突数，并且统计平均每高倍视野中长于其LC胞体直径长度的树突的数量。分析以上PLE实验组间及实验组与正常对照组的差异，采用配对样本及两独立样本均数比较的t检验。综合以上两项结果来评价LC树突的数量与长度在PLE中的变化。本实验应用SPSS11.5统计软件处理数据。

　　2 结果

　　2.1 光镜观察结果

　　PLE实验组在表皮层及真皮浅层均可见较多LC，呈蜘蛛状或蟹状， LC在PLE表皮中树突多而长，正常对照组的表皮中CD1a也有表达，但树突少而短;LC在PLE真皮中树突少而短(图1～3)，正常对照组的真皮中仅有少量表达(结果见表1)。PLE试验组表皮及正常对照组表皮中平均每个LC的二维树突数、平均每高倍视野中长于其LC胞体直径的树突数量结果见表2。

　　图1 LC在PLE实验组表皮中的表达图 图2 LC在PLE实验组皮肤中的表达图 图3 LC在正常对照组表皮中的表达图表1PLE实验组和正常对照组CD1a的表达数量注： CD1a的表达数量在PLE实验组表皮与真皮比较，P>0.01，无显著差异;PLE实验组与对照组表皮比较，t值为3.35，P<0.01，有显著差异;PLE实验组与对照组真皮比较，t值为5.56，P <0.01.表2PLE实验组表皮和正常对照组表皮LC二维数突数的表达 注：PLE实验组表皮和正常对照组表皮LC二维数突数量相比， t值为5.12， P<0.01;PLE实验组表皮和正常对照组表皮直径长于胞体的树突数量，t值为4.64， P<0.01，差异具有显著性.

　　2.2 LC电镜观察结果

　　电镜下可见PLE实验组中LC体积变大，核切迹变钝，核周异染色质增多，核膜内陷。胞质内可见一些大小不等的空泡，Birbeck颗粒数量较正常对照明显增多且致密线粗细不等，粗面内质网扩张，部分粗面内质网核糖体颗粒脱落，高尔基复合体分泌旺盛，分泌泡明显增多，未见明显的线粒体肿胀及溶酶体数量增加情况(见图4～6)。

　　3 讨论

　　LC主要存在于表皮，来源于骨髓的未成熟树突状细胞(DC)，其表面有多种标记抗原，包括IgG和IgE的FcR、C3b受体、MHCⅡ类抗原及S-100等抗原。主要免疫学功能是抗原呈递，能够有效地呈递位于表皮细胞表面的微生物抗原及肿瘤相关抗原，在介导变态反应、阻止微生物扩散及清除肿瘤性表皮细胞克隆等方面起重要作用[2]。

　　CD1a是递呈脂类抗原的分子，是DC的主要特征性标志，应用于DC分离、纯化和体外培养的鉴定[3]。LC是皮肤中惟一能与CD1a单克隆抗体结合的细胞。利用CD1a单克隆抗体并通过免疫组化染色技术，可清楚地显示LC的形态和分布，具有高度的敏感性和特异性[4]。Seite等[5]用不同波长的紫外线(UVR)照射皮肤，结果发现LC的密度及其标志性表面分子的表达明显下降，LC的形态也发生轻微的改变，如细胞体积变小，树突减少、缩短及部分断裂等。而本研究发现PLE患者皮损中LC的数量较正常皮肤组织明显增多，树突数量增多并变长，说明在PLE中LC受抗原的刺激而活化增殖，细胞功能处于活跃状态，吞噬活性增强。

　　PLE以紫外线诱导的免疫抑制失败为特征，并最终导致针对光诱导抗原的Ⅳ型过敏反应。有研究结果显示，PLE患者未经UVR照射，其表皮和真皮都存在LC，经6个MED照射后48 h和72 h，LC仍保持一定的数量[6]，本研究结果显示PLE实验组的表皮和真皮中LC数量无显著差异(P>0.05)，说明LC发生迁移受损。另外，PLE患者皮损的表皮及真皮LC数量均显著多于正常对照组，说明LC参与了PLE的发病机制。

　　Birbeck颗粒(BG)是LC的特征性标志，参与了LC摄取、处理、呈递抗原的全过程，BG的形成有利于防止抗原的过早丢失或防止抗原被溶酶体大量的降解[7]。本研究结果显示，在PLE患者皮损的LC中发现BG数量显著增多，粗面内质网扩张，高尔基复合体分泌旺盛，部分粗面内质网核糖体颗粒脱落，这可能由于在PLE发病的过程中，BG积极参与了抗原的呈递，保护抗原不受溶酶体的降解。BG增多可以认为是LC活化的标志，而粗面内质网扩张也说明其功能活跃。部分粗面内质网脱颗粒的现象提示LC受到损伤，导致LC损伤的原因可能是由于LC在吞噬抗原后表达抗原性，被CD8+T细胞识别为靶细胞杀伤所致，这与接触性皮炎中有关LC的研究结果相似。

　　总之，PLE皮损中大多数LC发生形态学变化，其细胞结构的形态学异常可能提示其功能的改变。因此，PLE皮损中LC的数目和形态学的改变提示这些LC参与了PLE发病的机制并且其功能受到损伤。

　　【参考文献】

　　[1] 赵辨. 临床皮肤病学[M]. 南京:江苏科学技术出版社, 2001. 585

　　[2] Romani N, Holzmann S, Tripp CH, et al. Langerhans cells-dendritic cells of the epidermis [J]. APMIS, 2003, 111(7-8): 725-740

　　[3] Fausch SC, Daslva DM, Kastw M. Differential uptake and cross-presentation of human papillomavirus virus-like particles by dendritic cells and Langerhans cells [J]. CancerRes, 2003, 6: 3478-3482

　　[4] 吴润晖. 朗格罕细胞组织细胞增生症研究进展及CD1a检测的应用[J]. 中国小儿血液, 2000, 4: 188-191

　　[5] Seite S, Zucchi H, Moyal D, et al. Alterations in human epidermal langerhans cells by ultraviolet radiation: quantitative and morphological study[J]. Br J Dermatol, 2003, 148(2): 291-299

　　[6] Kolgen W, Weelden VH, Hengst DS, et al. CD11b+ cells and ultraviolet-B resistant CD1a+ cells in skin of patients with polymerphous light eruption[J] . Invest Dermatol, 1999, 113: 4-10

　　[7] Valladeau J, Dezutter-Dambuyant C, Saeland S. Langerin/CD207 sheds light on formation of birbeck granules and their possible function in Langerhans cells[J] . Immunol Res, 2003, 28 (2): 93