恶性黑素瘤和色素痣中PI3K、AKT 、NRAS和ERK的表达及其意义

　　作者：陈凯 齐瑞群　高兴华　 张 莉 作者单位：1.青海大学医学院;2.中国医科大学

　　【摘要】 目的 检测PI3K、AKT、NRAS和ERK在色素痣和皮肤恶性黑素瘤组织中的表达情况，探讨它们的作用与意义。 方法 应用SP免疫组织化学技术检测14例色素痣标本和11例皮肤恶性黑素瘤标本中PI3K 、AKT、NRAS和ERK蛋白的表达。结果 在皮肤恶性黑素瘤组，PI3K蛋白阳性表达率在皮肤恶黑组明显高于色素痣组(P<0.05);NRAS蛋白阳性表达率在皮肤恶性黑素瘤组明显高于色素痣组(P<0.05)。AKT阳性表达率在皮肤恶性黑素瘤组和色素痣组比较无显著性差异(P>0.05);ERK阳性表达率在皮肤恶性黑素瘤组和色素痣组比较无显著性差异(P>0.05)。在皮肤恶性黑素瘤中，四种蛋白间的表达没有相关性;在色素痣中四种蛋白间的表达亦没有相关性。结论 检测PI3K与NRAS的表达状况有助于皮肤恶性黑素瘤与色素痣的鉴别诊断。

　　【关键词】 恶性黑素瘤 色素痣 信号分子 免疫组织化学

　　EXPRESSIONS OF PI3K,AKT,NRAS AND ERKPROTEIN IN MALIGNANT MELANOMA AND NEVUSPIGMENTOSUS AND THEIR SIGNIFICANCE

　　Chen Kai1，Qi Ruiqun2，Gao Xinhua2，Zhang Li1

　　(1.Medical College of Qinghai University ;2.China Medical University)

　　Abstract Objective To explores the expression of the four sigaling molecules: PI3K, AKT ,NRAS and ERK in cutaneous malignant melanoma and nevus pigmentosus， and to investigate their role and significance .Methods S-P method of immunohistochemistry was used to detect the expressions of PI3K, AKT ,NRAS and ERK in 14 nevus pigmentosus specimens and 11 cutaneous malignant melanoma specimens. Results In cutaneous malignant melanoma, the positive expression rates of PI3K was significantly higher than the rate in nevus pigmentosus (P<0.05 ).The positive expression rates of NRAS in cutaneous malignant melanoma was significantly higher than the rate of nevus pigmentosus (P<0.05 ). There is no difference between the AKT positive rate of nevus pigmentosus and malignant melanoma(P>0.05). The positive expression rates of ERK in nevus pigmentosus showed no significant difference in cutaneous malignant melanoma (P>0.05). Positive expression of four kinds of proteinsin malignant melanoma have no correlation with each other(P>0.05), and as well as in nevus pigmentosus(P>0.05). Conclusion It could help to differentially diagnose cutaneous malignant melanoma from nevus pigmentosus by detecting the expression rate of PI3K and NRAS .

　　Key words Nevus pigmentosus Malignant melanoma Signaling molecules Immunohistochemistry

　　近年来，国内外学者就MAPK(mitogen-activated protein kinase)/ERK(extracellular signal-regulated kinase)与PI3K(phosphatidylinositol 3 kinase)/AKT信号通路在皮肤恶性黑素瘤(简称“皮肤恶黑”)发生、发展中的作用做了一系列的研究，这些研究大多集中在单个通路的蛋白磷酸化和基因突变的方面，而对这两个通路中蛋白的表达总量及他们之间的关系方面的研究则较少。本研究应用免疫组化技术对色素痣和皮肤恶黑组织中NRAS、ERK、 PI3K和AKT的总量进行检测，分析它们间的联系与区别，以期能为皮肤恶黑与色素痣的鉴别诊断提供手段。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　取2007年08月～2008年07月中国医科大学第一附属医院皮肤科病理室存档的石蜡标本25例，诊断均明确无误，分为皮肤恶黑组与色素痣组，基本情况如表 1，两组的性别组成经均衡性检验显示无统计学差异，具有可比性(P≥0.05)。表1组织标本来源患者基本情况注：皮肤恶黑组与色素痣组的性别组成经均衡性检验，P=0.695.

　　鼠抗人PI3K抗体(bs-0128M)和兔抗人AKT抗体(bs-0115R)均从北京博奥森生物技术有限公司购买，兔抗人NRAS抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，鼠抗人ERK抗体(ZM-0153)及过氧化酶标记的链霉卵白素染色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　采用SP免疫组织化学法。对石蜡组织连续切片(3μm)，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水后行免疫组化染色，按各自说明书要求进行抗原修复。室温冷却后按如下方法除色素颗粒[1]：先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，除去多余水分后，每张切片加100 μl 0.5%高锰酸钾，室温下孵育5 min，流水冲洗，然后除去多余水分，每张切片加100 μl 2%草酸，室温下孵育2 min，流水冲洗5 min，再用蒸馏水冲洗2次，每次2 min。余步骤按SP法试剂盒说明书进行操作。 AEC显色，苏木素复染，中性树胶封固。 PBS代替一抗作为阴性对照。NRAS、ERK、PI3K和AKT抗体工作液浓度分别为： 1:50、1：50、1：200、1：100。

　　1.3 结果判定方法

　　PI3K、NRAS蛋白阳性细胞均为胞膜和(或)胞浆出现红色颗粒者。AKT 、ERK蛋白阳性细胞均为胞浆和(或)胞核中出现红色颗粒者;计数及评分方法：两位病理科大夫采用双盲法均对每张切片观察5个典型高倍镜视野，分别计数每个视野下所有的阳性细胞数和总细胞数，然后将二人对同张切片所记的共10个阳性细胞数进行累计，总细胞数作同样处理，最后算出阳性细胞所占的百分比。判定标准[2]：阳性细胞百分比≤10%者为阴性，记作0分;余为阳性，其中11%～30%者为1分，31%～70%者为2分，>70%者为3分。

　　1.4 统计学处理方法

　　采用SPSS15.0统计软件包进行数据处理，使用四格表资料Fisher确切概率法进行显著性检验，同时做Spearman秩相关分析，检验标准为α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 四种蛋白的免疫组化染色情况

　　各蛋白在色素痣与皮肤恶黑的表达情况见图1。PI3K AKT NRAS ERK

　　图1 PI3K、AKT、NRAS、ERK 蛋白在色素痣与皮肤恶黑中的表达

　　A-D：皮肤恶黑中的四种蛋白的表达;E-H：色素痣中的四种蛋白的表达(SP，×400)

　　2.2 四种蛋白阳性率的比较(见表1～2)　表2PI3K和AKT在色素痣与皮肤恶黑中的表达表1显示，PI3K蛋白阳性表达率在皮肤恶黑组明显高于色素痣组(P<0.05)，AKT蛋白阳性表达率在色素痣组与皮肤恶黑组中没有差异(P>0.05)。表3NRAS和ERK在色素痣与皮肤恶黑中的表达表2显示，NRAS蛋白阳性表达率在恶性黑素瘤组明显高于色素痣组(P<0.05)，ERK蛋白阳性表达率在色素痣组与恶性黑素瘤组中没有差异(P>0.05)。

　　2.3 四种蛋白表达的相关性

　　在色素痣组中，NRAS、ERK、PI3K和AKT的表达其相互间无相关性(P>0.05)。在皮肤恶黑组中，NRAS、ERK、PI3K和AKT的表达其相互间同样无相关性(P>0.05)。

　　3 讨论

　　3.1 PI3K、AKT蛋白在色素痣及皮肤恶性黑素瘤中的表达

　　PI3K和AKT均需磷酸化后方可发挥相应的作用， PI3K是有一个p110催化亚基和一个p85调节基组成的异源二聚体，具有激酶活性。当PI3K被受体RTK(receptor tyrosine kinase)激活后，可催化PIP2 (phosphatidylinositol -4,5- bisphosphate)磷酸化为PIP3(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate),然后PIP3使AKT发生磷酸化。AKT是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其磷酸化后激活下游的GSK-3(glycogen synthase kinase 3)、Bad(Bcl-2-associated death promoter)和caspase-9等，达到调节细胞分裂、分化及凋亡等的作用。大量持续活化的AKT还可促进细胞持续生长，使细胞存活，并促进间质血管生成[3]，从而产生致癌作用。这两种蛋白的总量一般受到由转录与翻译构成的合成与降解的调控。目前关于该方面的资料较少，戴冰冰[4]等人则发现PI3K的p110催化基的mRNA 3’ 非翻译区可能存在基因表达负调控区;而目前AKT的总量调节的具体过程尚不清楚。

　　本研究中，PI3K在色素痣组织几乎没有表达，而AKT则广泛表达，提示PI3K/AKT信号转导途径存在等良性皮肤肿瘤中，PI3K处于信号通路的最上游，经过级联反应放大效应，可将其变化放大数百倍，只需极少量即可行使其信号转导功能;而AKT位于信号通路的下游，较直接地产生信号传递的作用，通过参与多种蛋白的调节过程发挥作用，所以AKT表达总量较多。

　　本研究中，PI3K在皮肤恶黑组织中的表达较色素痣组织高，而AKT的表达则无明显变化，提示在皮肤恶黑素组织中，可能存在PI3K基因表达的负转录调控与其降解效应，使皮肤恶黑组织中的PI3K总量显著高于色素痣中的，检测色素痣与皮肤恶黑组织中的PI3K总量，有助于区别两者，为皮肤恶黑的鉴别诊断提供帮助。本实验结果也得到了Sun[5]等的研究支持：与正常喉组织相比，人喉乳头状瘤中PI3K过表达。与色素痣组织相比，皮肤恶黑AKT总量无明显变化，可认为是其合成与降解处于相对的动态平衡状态。

　　3.2 NRAS、ERK蛋白在色素痣及皮肤恶性黑素瘤中的表达

　　NRAS与ERK均需磷酸化方能发挥相应的作用。NRAS位于MAPK/ERK通路最上游，直接对细胞外信号产生反应，将信号转导进细胞。NRAS磷酸化后，可对MAPK/ERK通路蛋白及MEKK1(MEK kinase 1)产生效应，发挥多种作用[6，7]。ERK位于MAPK/ERK路径的末端，RAS的下游。目前认为是MAPK/ERK路径的效应子[8]，活化的ERK可以磷酸化ELK-1(Ets like transcription factor-1)、c-FOS、c-JUN、NF-Κb(nuclear factor of kappa B)等蛋白[9]，在细胞多种正常生理过程中(如细胞生长、发育、分裂、死亡等)发挥作用。ERK过度活化后，还可通过影响cyclin、MITF(microphthalmia-associtated transcription factor)、MMP(matrix metalloprotease)等因子促使细胞生长过度和分化不良，致细胞间粘附力下降促进肿瘤的发展。这两种蛋白的总量同样受到由转录与翻译构成的合成与降解的调控，一种名为let-7的MicroRNA可结合到NRAS基因上,从而抑制NRAS基因的转录[10，11];Z. Lu等[12]则发现MEKK1活化后具有E3(Estriol)泛素连接酶活性，可使ERK泛素化而降解。

　　本研究显示，在色素痣组中NRAS与ERK都有一定表达，提示MAPK/ERK信号转导途径在良性皮肤肿瘤中即存在，行使其信号转导功能，在细胞生长、发育、分裂、死亡等中发挥作用。

　　本研究显示，与色素痣组织相比，在皮肤恶黑组织中有高NRAS表达，而AKT的表达无明显变化。提示在多种致癌因子的作用下，由let-7 MicroRNA介导的NRAS转录抑制与NRAS的降解相互作用，最终致NRAS蛋白总量增加，进一步，可认为通过检测色素痣与皮肤恶黑中的NRAS总量，为皮肤恶黑的鉴别诊断提供帮助。在色素痣与皮肤恶黑组，ERK总量无明显变化的原因可能是，虽然皮肤恶黑中增多的NRAS可激活MEKK1，但仅有磷酸化的NRAS才可能激活MEKK1，在皮肤恶黑组织中磷酸化的NRAS可能未增多，或其他因素同时也影响MEKK1活化，从而使其介导的ERK在降解过程未发生变化，或虽MEKK1介导的降解过程未发生变化，但其可能在合成过程中发生了变化，最终使ERK总量未发生显著变化。

　　3.3 四种蛋白表达之间的关系

　　本研究显示，无论是在皮肤恶黑组还是在色素痣组，这四种蛋白的表达之间均无相关性。但从上文可知，至少NRAS与ERK的表达间应是有相关性的，所以出现本实验的结果可能原因是，本实验例数过少，代表性不够;本实验外加了除色素颗粒这一可能影响抗原性的步骤，使蛋白表达间的关联不易被发现。

　　【参考文献】

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