人表皮黑素细胞与角质形成细胞体外共培养模型的构建

　　作者：江蕾薇， 陆洪光** 作者单位：(贵阳医学院附院 皮肤科， 贵州 贵阳 550004)

　　【摘要】 目的： 体外构建人表皮黑素细胞与角质形成细胞直接接触的共培养模型。方法： 胰酶消化包皮的表皮，分别获取纯化的角质形成细胞和黑素细胞，将第3代角质形成细胞接种于培养瓶中，48 h后以1∶10(表皮黑素细胞∶角质形成细胞)的比例接种黑素细胞。结果： 黑素细胞与角质形成细胞混合培养5 d后，培养瓶瓶底培养物逐渐变为浅灰色，继续培养，颜色逐渐加深;倒置显微镜下观察到黑素细胞与角质形成细胞共同存活，细胞生长良好，并通过树突发生联系。结论： 成功构建了黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型，为进一步研究色素问题奠定了基础。

　　【关键词】 黑素细胞; 角质形成细胞; 共同培养; 人

　　The Construction of A Cocultivating Model of Keratinocytes

　　and Melanocytes in Vitro

　　JIANG Leiwei, LU Hongguang

　　(Department of Dermatology, The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)

　　[Abstract] Objective: To construct a cocultivating model of keratinocytes (KCs) and melanocytes (MCs) in vitro.Methods： Singlecell suspensions were obtained by treating the isolated preputial epidermis with pancreatin, then KCs and MCs were respectively purified at the second passage.The third passage of KCs was transplanted into culture flask and incubated for 48 hours.MCs were then added into the culture flask making a ratio of 1∶10 of MCs：KCs.Results： The model showed a light gray color in 5 days of cultivating, and the color became darker gradually when cultivating continued.Alive MCs and KCs were observed in the coculture system and dendritic contact between them was found with inverted microscopy. Conclusion： The cocultivating model of MCs and KCs has been constructed successfully, which provides basis for further study.

　　[Key words] melanocytes;keratinocytes;coculture; persons

　　人表皮中的黑素细胞(melanocytes，MCs)位于基底层，通过树突结构和周围角质形成细胞(keratinocytes，KCs) 发生接触和联系，将MCs内的黑素小体传递至KCs内，构成了“表皮黑素单元”。生理情况下，角质形成细胞通过直接的细胞间连接控制黑素细胞的生长、形态、树突形成和抗原表达[1]，而采用黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养方式来模拟“表皮黑素单元”的结构，能够使用更符合生理学特点的模型来进行一系列研究。以前的共培养中，多采用鼠系的永生化细胞[2]，并且两种细胞接种比例也有较大差异。2009年11月，利用包皮为组织来源分离培养的黑素细胞、角质形成细胞来构建直接接触的混合培养模型，报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞的组织来源 泌尿科6～20岁健康男性包皮环切术后的正常包皮组织，患者知情同意。

　　1.1.2 试剂和仪器 角质形成细胞无血清培养基 (keratinocytesSFM) 购自Gibco公司，254培养基(M254)和人黑素细胞生长添加成分(human melanocyte growth supplement，HMGS)购自Cascade生物公司。低糖型DMEM培养基、谷氨酰胺、胰蛋白酶均购自Sigma公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物有限公司，青霉素购自哈尔滨制药总厂，链霉素购自华北制药厂。左旋多巴(LDopa)购自上海捷瑞生物有限公司，DHanks溶液和PBS液自配。细胞培养箱购自美国Thermo公司，倒置显微镜购自日本Olympus公司，超净工作台购自苏州净化设备公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 培养基配制 完全角质形成细胞无血清培养基：角质形成细胞无血清培养基(KSFM)添加表皮生长因子(EGF)2 μg/L、牛垂体浸出液25 g/L、谷氨酰胺0.3 g/L、青霉素100 U/ml,链霉素100 mg/L。完全黑素细胞培养基：254培养基(M254) 添加1%HMGS，谷氨酰胺0.3 g/L、青霉素100 U/mL,链霉素100 mg/L，备用。

　　1.2.2 原代角质形成细胞和黑素细胞的培养 将包皮在无菌条件下用PBS(含100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素)冲洗5遍，用眼科剪去皮下组织,将皮肤组织剪成宽约3 mm的细长条，放入2.5 g/L Dispase酶中4 ℃消化16～18 h。将表皮与真皮分离后,将表皮剪碎，加入0.25%胰酶、0.01%EDTA室温下消化2～3 min后，等量分为2瓶，分别标记A、B。A瓶中加入含10%FBS的DMEM终止消化，离心(1 000 r/min)，弃上清液;PBS重悬细胞，再离心，弃上清液;用完全黑素培养基混悬，计数板计算，调整细胞密度为2×106/ml，接种于一次性培养瓶中。B瓶中加入完全KSFM培养基终止消化，离心(1 000 r/min)，弃上清液;PBS重悬细胞，再离心，弃上清液;用完全KSFM混悬，计数板计算，调整细胞密度为2×106/ml，接种于一次性培养瓶中。A、B两瓶接种的细胞置5%CO2、37 ℃孵箱中培养，24 h后首次换液去除未贴壁的细胞，以后2～3 d换液1次。15～20 d后培养细胞达到70%～80%融合状态时，传代纯化培养。分别取第3代MCs、KCs用于实验。

　　1.2.3 角质形成细胞和黑素细胞共培养 (1)KCs细胞接种：倒置显微镜观察KCs生长状态，取第3代对数生长期KCs;吸去培养基，以PBS液清洗两遍，加入0.25%胰蛋白酶，轻摇培养瓶，消化贴壁细胞5 min。镜下观察细胞由卵圆形变圆、细胞间隙增大，少量细胞开始脱落时，加入完全KSFM培养基终止消化。吹打培养瓶壁上细胞，离心收集细胞(1 000 r/min，5 min)，弃上清液;重悬于5 ml的PBS，离心，弃上清液;重悬于完全KSFM培养基制成细胞悬液，计数，调整细胞浓度至2×105/ml，接种到培养瓶内，置于5%CO2、37 ℃环境中孵育48 h。(2)MCs细胞接种：倒置显微镜观察MCs生长状态，取第了3代对数生长期MCs;吸去培养基，以PBS液清洗两遍;加入0.25%胰酶、0.01%EDTA，轻摇培养瓶，消化贴壁细胞1～2 min;镜下观察细胞由树突状变圆、细胞间隙增大，少量细胞开始脱落时，加入含10%FBS的DMEM终止消化;吹打培养瓶壁上细胞，离心收集细胞(1 000 r/min，5 min)。弃上清液;重悬于完全黑素培养基中制成细胞悬液，计数，调整细胞浓度至2×104/ml，接种于已有KCs生长48 h的培养瓶中, 置于5%CO2、37 ℃环境中孵育。共培养的培养基为完全角质形成细胞无血清培养基和完全黑素细胞培养基的混合物(1∶2)，2 d换液，并在倒置显微镜下观察细胞接种后的生长情况。

　　1.2.4 黑素细胞的鉴定(LDopa染色) 将培养的第2代MCs接种于有盖玻片的6孔培养板中，待细胞贴壁后用冰PBS漂洗3次,5%甲醛固定细胞30 min，PBS漂洗3次，加入适量的0.1% LDopa 37 ℃孵育约4 h，PBS漂洗3次;再用10%甲醛固定10～20 min后，PBS漂洗3次。

　　2 结果

　　2.1 表皮黑素细胞培养

　　因人黑素细胞培养基及添加成分有利于黑素细胞的贴壁、增殖，接种数小时后，可见表皮黑素细胞伸出树枝状突。在此培养基中大部分KCs悬浮，换液可部分被去除，残余的KCs在传代时用差别胰酶处理。图1为2代MCs，几乎无角质形成细胞和成纤维细胞污染。倒置显微镜下观察，MCs呈树突状，两极、三级或多级，部分区域连接成网，LDopa染色呈黑色(图1)。

　　2.2 角质形成细胞培养

　　最初接种的表皮细胞中有大量的角质形成细胞、少许黑素细胞及成纤维细胞，完全KSFM培养基不利于黑素细胞生长，再使用差别胰酶处理后，留下纯净的KCs。差别胰酶处理后的第2代KCs，细胞已经融合，呈典型上皮细胞铺路石样特征，单个细胞为圆形、多角形，轮廓清楚、折光性好(图2)。图2 第2代角质形成细胞 (×400)

　　2.3 黑素细胞与角质形成细胞共培养

　　第3代MCs与KCs以1∶10混合培养比例,在培养过程中培养瓶瓶底培养物逐渐出现颜色变化，培养第5天培养物逐渐变成浅灰色，随着培养时间延长，颜色逐渐加深(图3a～c)。倒置显微镜下观察到黑素细胞与角质形成细胞共培养第2、5、9天，角质形成细胞逐渐增多，黑素细胞逐渐减少，黑素细胞与角质形成细胞通过树突发生一定联系，随着培养时间的延长，黑素细胞与角质形成细胞通过树突联系增多(图4a～c)。注：a为培养3 d,b为培养5 d,c为培养9 d。

　　3 讨论

　　自1988年Halaban[3]首次成功地建立黑素细胞和角质形成细胞体外共培养模型以来，因其能较好地模拟皮肤的生理状况而被众多学者相继采用、改进，并进行一系列研究。本研究是在体外构建接近的正常生理结构的黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型，在培养角质形成细胞时发现，与单纯应用完全KSFM 培养的细胞相比，添加血清后KCs体积增大，分化程度明显增高，细胞由卵圆形变为多角形，复层上皮的范围增大，基质分泌增多，复层上皮中央可见角化物。揭示血清中可能存在促进KCs分化的因子，加入血清或以血清中止消化均对细胞的扩增传代不利[4]。实验中，在KCs传代时用完全K-SFM 替代既往常用的含10%FBS的DMEMF12(3∶1)来终止消化，实验结果表明，获得的角质形成细胞活力更高。实验中，两种细胞体外共培养时，将MCs、KCs按照更接近生理状态下表皮基底层的比例，即1∶10的比例接种后用混合培养液培养[5]。因角质形成细胞定植需要的时间长于黑素细胞，且成集落样、小片状生长方式，故采用朱文元等[5]的方法，预先接种角质形成细胞，2 d后再接种黑素细胞，这比两种细胞混合同时接种更符合细胞各自的生长特性。

　　在培养的过程中，培养瓶瓶底培养物逐渐呈现浅灰色，随着培养时间的延长，颜色逐渐加深，表明混合培养的过程中黑素细胞与角质形成细胞相互刺激，促进了黑素小体由黑素细胞向角质形成细胞的转运。倒置显微镜下观察到在共培养条件下，黑素细胞与角质形成细胞均存活良好。随着共培养时间的延长，黑素细胞逐渐减少，角质形成细胞逐渐增多，它们通过树突的联系亦增多.提示共培养体系中角质形成细胞可能控制了黑素细胞的增殖，使两者的比例控制在一定范围内[6]。实验中还发现，随着共培养时间的延长，黑素细胞树突明显增多，并与多个角质形成细胞发生联系，这与体内情况一致。

　　黑素细胞和角质形成细胞接触性共培养方法包括单层细胞共培养和重建三维表皮结构的共培养，虽然后者黑素细胞所处的环境更接近体内，但构建色素化皮肤类似物操作复杂，周期较长，大规模用此做模型则受到一定程度的限制[7];而前者模型的构建简单易得，周期较短，能够在一个类似生理环境的系统中研究MCs和KCs的相互作用，并可以进行大规模的初步筛选各种色素调节剂，故该模型的构建对色素性疾病发生机制及治疗的研究非常重要。

　　【参考文献】

　　[1]Kippenberger S，Bemd A，BereiterHahn J，et a1.Transcription of　melanogenesis enzymes in melanocytes：dependence upon culture conditions and cocultivation with keratinocytes[J].Pigment Cell Res, 1996(9)：179-184.

　　[2]Yoon TJ, Hearing VJ.Coculture of mouse epidermal cells for studies of pigmentation[J].Pigment Cell Res,2003(16)：159-163.

　　[3]Halaban R，Langdon R，Brichall N，et a1.Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes[J].Cell Biol,1988(107):1611-1619.

　　[4]卢宁，刘玉峰，王刚，等.人角质形成细胞培养的实验研究[J].中国美容医学，2004(5)：522-524.

　　[5]张汝芝，朱文元，马佳.表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞接触性共培养方法的建立[J].中华皮肤科杂志，2006(10)：596-599.

　　[6]张迪敏，李永伟，许爱娥.黑素细胞与角质形成细胞共培养的应用进展[J].中国美容医学，2005(2)：236-238

　　[7]T.Tadokoro，N.Kobayashi，B.Z.Zmudzka，et a1.Hearing.UV induced　DNA damage and melanin content in human skin differing in racial/ethnic origin and photosensitivity[J]. FASEB J，2003(17)：1177-1179.

　　(2010-01-22收稿，2010-02-24修回)第35卷 第2期2010年4月 贵阳医学院学报JOURNAL OF GUIYANG MEDICAL COLLEGE Vol.35 No.22010.4