细胞滴片间接免疫荧光实验技术的探讨

作者：张林甦，陈 明，王传明    作者单位：( 黔南民族医学高等专科学校，贵州都匀558003) 【摘要】  目的：探讨在有限条件下简化细胞滴片间接免疫荧光实验操作技术。方法：以大鼠胸腺细胞为抗原，兔抗鼠抗血清为一抗，FITC羊抗兔IgG荧光抗体为二抗做细胞滴片的间接免疫荧光染色，荧光显微镜观察结果。结果：细胞悬液浓度在105～106个/ml为宜，新鲜细胞固定后可长期保存备用，冻存细胞则不能使用;固定剂可选10%甲醛、甲醇等，也可不用固定剂;粘片剂也可不用;平整的试管架代替湿盒更方便。结论：细胞滴片的间接免疫荧光实验操作步骤可简化，以减少实验开支。

【关键词】  细胞滴片;间接免疫荧光;简化;操作技术

　　免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术，是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的荧光素显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量研究的一类方法，是标记免疫技术中发展最早的一种。免疫荧光实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，可分为直接法、间接法、补体法等 [1]。细胞滴片的间接免疫荧光法属于免疫组化的一种，可用于抗体(抗原)的定性、定量及定位等，是目前广泛应用的一种实验技术。从文献中很容易找到相关的操作步骤，但由于有些实验室条件有限，实验常常无法进行。笔者通过实验摸索出更为简化的操作技术，现报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物 4周龄SD大鼠,、新西兰兔，购自贵阳医学院实验动物中心。

　　1.2 仪器 NIKON正置荧光显微镜、NIKON数码照相机、光学显微镜、大龙移液器、振荡脱色仪、恒温水浴锅、染色架、离心机、组织研磨器、血球计数板。

　　1.3 试剂及配制方法 FITC标记羊抗兔IgG荧光抗体(武汉博士德生物工程公司)、10%正常山羊血清(武汉博士德生物工程公司)、完全弗氏佐剂、伊文斯兰(SIGMA公司)，其余试剂均为分析纯。1%伊文斯兰的配制：称取伊文斯兰0.1 g, 10 ml 0.01 mol/L PBS溶解后置 4℃冰箱保存。用时按0.01%浓度稀释加入荧光抗体(二抗)中，以消除非特异染色。0.01 mol/L PBS的配制：称取KH2PO4 0.25 g，Na2HPO4 1.23 g,，NaCl 18 g, 溶至100 ml 蒸馏水中得原液，用时取原液50 ml，加蒸馏水950 ml，混合后即为应用液。本实验所有PBS均指此溶液。缓冲甘油的配制：先配制pH8的磷酸缓冲液(0.1 mol/l Na2HPO4 94.50 ml 与 0.1 mol/l NaH2PO4 5.50 ml混合即可)，再取9份分析纯甘油加1份pH8的磷酸缓冲液混匀即可。作为封片剂使用。

　　1.4 方法

　　1.4.1 兔抗鼠抗血清的制备 抗血清(一抗)按文献[2-5]报道的方法制备，此抗血清用PBS稀释2 000倍备用。

　　1.4.2 大鼠胸腺细胞悬液的制备 大鼠处死，取出胸腺放入预冷的PBS缓冲液，用组织研磨器研磨得胸腺细胞原液，1 000 r/min 离心10 min，弃上清，用PBS缓冲液重悬，重复3次得细胞悬液，用PBS稀释，调细胞浓度1×105， 1×106(个/ml)备用。

　　1.4.3 大鼠胸腺细胞抗原片的制作 用移液器取以上大鼠胸腺细胞悬液10 μl垂直滴加在干净干燥普通玻片上，室温晾至标本边缘已干但中间还未干透时滴加固定剂25 μl，待固定剂干后，将抗原片用切片盒收好置-20℃保存备用。

　　1.4.4 荧光染色[6] 先取出抗原片室温下复温20 min，然后按下列步骤进行。(1)滴加1滴10%正常山羊血清封闭30 min，过PBS三缸，每缸5 min，置脱色床上振荡洗涤。(2)滴加稀释2 000倍的抗血清(二抗)约30 μl，覆盖已知抗原标本片，将玻片置平整的试管架上平放，37℃水浴箱保温60 min。(3)取出玻片，置于染色架上，先用滴管吸取PBS冲洗1次，然后按顺序过0.01 mol/L，PBS三缸浸泡，每缸5 min，置脱色床上振荡洗涤。(4)取出玻片，甩掉多余水分，但不使标本干燥，滴加50～100 μl用PBS作50倍稀释的荧光标记的抗体(二抗，其中含终浓度为0.01%伊文斯兰)。(5)将玻片平放在试管架上，37℃水浴锅保温60 min。(6)取出玻片，置于染色架上，先用滴管吸取PBS冲洗1次，然后按顺序过0.01 mol/L，PBS三缸浸泡，最后一缸为蒸馏水，每缸5 min，置脱色床上振荡洗涤。(7)擦去玻片周围的水，用缓冲甘油封片，置荧光显微镜下镜检并拍照。

　　注意：(1)滴加液体都应有一个“砸片”的操作，即移液器在玻片垂直上方一定距离，使液滴落在破片上有一定的冲击力度，但是应避免液滴落下全部溅散，以吸头嘴距离玻片10～20 cm为宜。(2)整个过程勿使样品干透，应在其中间还未全干时加入试剂。

　　2 结果

　　2.1 不同固定剂对实验结果的影响 10%甲醛、甲醇、丙酮、四氯化碳对大鼠胸腺细胞均有较好的固定效果(见图1、2)，但是丙酮有刺激性气味，四氯化碳干燥时间较长;95%乙醇对大鼠胸腺细胞有一定的固缩作用，会影响荧光染色效果(图3)。建议使用甲醇或10%甲醛。不用固定剂的新鲜大鼠胸腺细胞能很好地固着在普通玻片上，对实验结果无明显影响(图4)。

　　2.2 不同浓度细胞悬液对实验结果的影响 本实验显示，细胞悬液的浓度过大(大于108个/ml)，荧光重叠(图5)，影响观察。较适合的细胞悬液浓度为105～107个/ml(图6)，105个/ml(图7)效果最佳。

　　2.3 血清封闭对实验结果的影响 不用10%的山羊血清封闭则纤维状非特异性荧光较多(图8)，影响观察，封闭的荧光效果更好。因此血清封闭步骤不宜省略。

　　2.4 新鲜细胞与冻存细胞对实验结果的影响 新鲜的大鼠胸腺细胞及时制作滴片有较好的附着力，且细胞形态完整，说明保存于-20℃不影响荧光染色效果。但冻存后复苏的细胞损失较多，极少能保持完整形态(图9)，因此不能将细胞冻存后进行荧光染色。

　　3 讨论

　　3.1 玻片的选择和处理 在制作细胞滴片时，往往对玻片清洁度要求很高，或只能用有凹孔的玻片。本文采用经10%盐酸浸泡和95%乙醇处理的普通玻片，实验证实，对观察结果无明显影响。 因为细胞悬液在玻片上固定，经过多次PBS洗涤，样品干后印迹可见，滴加试液和二抗后，伊文斯兰将样本染成肉眼可见的蓝色，荧光观察时也极易找准观察位置。另外，用普通玻片代替有凹孔玻片，还可减少实验开支。

　　3.2 粘片剂的使用 以往常用蛋白甘油作为粘片剂[7]，费劲不好使;本实验直接用细胞滴片，样本有较好的附着力，既可省略粘片剂，又可简化实验步骤和节省经费支出。

　　3.3 湿盒 选择一个平整的试管架将玻片放在架上，再将其放入水浴锅盖上盖子进行保温，因水浴锅内有足够的湿度，玻片上的试液不会干燥，确保了实验的顺利完成，简单实用。

　　3.4 荧光抗体的影响及重复使用 荧光抗体因生产厂家不同价格差异较大，本实验采用两种价格不同的荧光抗体作对比，发现实验结果无明显差别，证明可根据实验精度要求和经费情况选择合适价位的试剂。本实验还证实荧光抗体至少可以重复使用一次，并不影响实验结果。

　　间接免疫荧光法方法大多实验条件要求较高，导致一些实验室难以开展。本实验结果表明，在实际工作中可以根据现有条件及实验要求对实验做一些改进、简化，既省力又省钱，同样可以达到预期效果。

　　致谢：本实验得到贵阳医学院免疫教研室左丽教授、陈阿英、杨艳、崔冬冰、龙世祺、赵青，黔南民族医学高等专科学校卢亚莲等老师的支持和帮助，在此一并表示衷心感谢。

【参考文献】　　[1] 沈关心，周汝麟. 现代免疫学实验技术[M]. 武汉: 湖北科学技术出版社, 1998：105.

　　[2] 张克非，张亮. 兔抗鼠胸腺细胞抗血清的制备及应用[J].遵义医学院学报，2003，26(1)：76-78.

　　[3] Yamamoto N, Ishizaki M. Anti-Thymocyte antibody induced masangioalitic nephritis[J]. Nephrology, 1991，1：1004-1009.

　　[4] 朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社，2000：1-15.

　　[5] 刘静芳，温进坤.抗胸腺细胞血清法诱发大鼠系膜增殖性肾炎模型[J].中国病理生理杂志，1999，15(3)：274-275.

　　[6] 刘玉斌.动物免疫学实验技术[M]. 长春: 吉林科学技术出版社，1989：133.

　　[7] 蔡文琴,王泊沄. 实用免疫细胞化学[M]. 成都: 四川科技出版社,1983：44.