人皮肤成纤维细胞系的鉴定及老化检测

作者：曹晨华 纪丽曼 耿娅 刘国芳    作者单位：050015 石家庄市，华北制药集团新药研究开发责任有限公司【摘要】  目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞体外分离、培养及鉴定的方法。方法 以包皮组织为材料，采用胶原酶消化，分离、培养细胞，倒置显微镜观察，同时进行免疫细胞化学鉴定和β半乳糖苷酶染色。结果 分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖。波形蛋白免疫细胞化学染色95%以上为阳性。随成纤维细胞的连续传代培养β半乳糖苷酶表达呈递增趋势。结论 该方法在体外可以获得高纯度的成纤维细胞。

【关键词】  成纤维细胞;鉴定;细胞衰老;β半乳糖苷酶

Identification and aging detection of human skin fibroblast cell-line CAO Chenhua,JI Liman, GENG Ya,et al. NCPC New Drug Research and Development CO.,Ltd,Shijiazhuang 050015,China

　　【Abstract】 Objective To explore the method of isolation, cultivation and identification for human skin fibroblasts in vitro. Methods Fibroblasts was dissociated and harvested by collagenase,which were isolated from the normal prepuce by circumcision. The performance of cells’growth was observed with light microscope.The cells’certain antigens were detected by immunohistochemical method and βgalactosidase histochemical staining. Results The isolated fibroblasts could grow and proliferate in vitro，and over 95% of them were positive in vimentin by immunostaining. The expression of SAβGal in old cells tendsed to be more apparent than that in young cells. Conclusion The method can obtain highly pure fibroblasts in vitro.

　　【Key words】 fibroblast; identification; cell aging; βgalactosidase

　　成纤维细胞中间丝的结构蛋白为波形蛋白，不同于上皮细胞的角蛋白，也不同于肌细胞的桥连蛋白，成为不同种类细胞分类鉴定的相对特异性标志[1]。我们对成纤维细胞的标志性蛋白——波形蛋白在不同个体、不同代龄间的表达进行了检测，在趋向老化的过程中对β半乳糖苷酶的表达进行了检测，着重研究人皮肤成纤维细胞的鉴定及老化检测，以期为成纤维细胞体外培养及其在医学美容和组织工程产品中的应用提供优质、可靠、充足的细胞来源。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂和仪器 DMEM 培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(民海)，胰蛋白酶(Hyclone公司)，胶原酶(Sigma公司)，CK19(角蛋白19)，鼠抗人波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体，DAB试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司，细胞衰老β半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天生物技术公司);洁净工作台(苏净集团公司)，高速离心机，细胞培养箱(Forma公司)，倒置显微镜(Leica公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞分离：无菌条件下取正常人体包皮，酒精消毒，分离皮肤和皮下组织，去除脂肪和疏松结缔组织，将其剪成2～3 mm的皮条。用2.4 U/ml中性蛋白酶4℃过夜消化，分离真皮表皮。将揭下表皮后所剩真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮分剪成糊状(组织大小约为0.1 cm3)，加0.2%胶原酶浸没组织，37℃孵箱中消化1～4 h，以将组织基本上消化散开看不到组织块为度;加DHanks平衡盐液离心1 500 r/min，5 min，弃上清，反复5遍，弃上清，加成纤维细胞培养液(含10%胎牛血清的DMEM液)制成细胞混悬液，接种至T-25培养瓶中，置37℃、5%CO2、湿度90%的孵箱中培养24 h后更换培养液，以后每3天换1次培养液，大约7～9 d左右长满后传代。

　　1.2.2 细胞传代：原代培养的成纤维细胞生长汇合率达90%时，向培养瓶内加入0.25%的胰蛋白酶，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入成纤维细胞培养液终止消化，按1∶3传代至新的培养瓶中，置37℃, 5%CO2，湿度90%的孵箱中培养。3～5 d待细胞生长汇合率达80%以上时即可再次传代。

　　1.2.3 细胞形态学观察及免疫细胞化学鉴定：每天用倒置显微镜观察细胞生长和增殖情况，拍照记录细胞形态。细胞鉴定采用免疫化学染色ABC法,接种适当代龄细胞于干净无菌盖玻片上，正常培养，待细胞生长汇合率达到50%～80%时进行免疫化学染色。一抗分别为鼠抗人波形蛋白单克隆抗体，CK19(角蛋白19)为阴性对照，PBS为空白对照，吸出培养液PBS清洗1遍，冰冻丙酮：甲醇(1∶1)室温固定30 min，3%H2O2去离子水室温孵育10 min，封闭用山羊血清室温孵育30 min，滴加一抗4℃孵育过夜，滴加二抗(生物素标记山羊抗小鼠IgG)37℃孵育30 min，然后滴加HRP标记的链霉卵白素37℃孵育30 min，DAB显色，复染，封片。每部操作之间均用PBS清洗。见表1。表1 免疫细胞化学检测

　　1.2.4 细胞老化检测：分别取不同个体、不同代龄的成纤维细胞，适量接种于盖玻片上，待细胞生长汇合率达到50%～80%时，使用细胞衰老β半乳糖苷酶染色试剂盒进行检测。吸出培养液，PBS洗1遍，加1 ml β半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min，吸出固定液，PBS洗3次，每次3 min，加1 ml染色液，37℃孵育过夜，在普通光学显微镜下观察。吸出染色液，加2 ml PBS，4℃可保存数天，或加上封片液封片后，4℃可保存较长时间。显微镜下观察计数，蓝染细胞为阳性细胞，每次随机挑选视野计数至少500个细胞，得到阳性细胞百分率，即衰老细胞率(阳性细胞数/总细胞数×100%)。

　　1.3 统计学分析 应用SPSS 15.0统计软件，对3批细胞分别进行直线相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 成纤维细胞的分离和培养 传代细胞在接种24 h内贴壁生长，细胞逐渐伸展。约3～5 d左右待细胞生长汇合率达80%以上时即可再次传代，细胞可传40代左右，建立起来源与人皮肤的成纤维细胞系。

　　2.2 成纤维细胞形态学观察 成纤维细胞刚接种尚未贴壁时呈球形，贴壁后细胞逐渐伸展，呈梭形、长条形、多角形或不规则形2～3 d即呈汇合状态。细胞密度低时细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。细胞密度高时，细胞相互平行排列或呈放射状和漩涡状排列。随着细胞代龄的增高，细胞逐步出现老化现象，镜下观察可见细胞体积变大、形状扁平，过度伸展，伸展末端细长有分支，生长缓慢。

　　2.3 成纤维细胞的鉴定 ABC法对成纤维细胞进行波形蛋白免疫细胞化学染色。结果成纤维细胞胞浆内见大量棕黄色颗粒，核为蓝色，阴性对照及空白对照均未见阳性表达。对18个批次不同代龄的细胞进行了39次检测，除3次检测阳性率分别为97%、95%、97%外，其余36次检测阳性率均为100%，见表2。表2 波形蛋白检测结果表3 β半乳糖苷酶染色结果

　　2.4 成纤维细胞老化检测 对成纤维细胞β半乳糖苷酶染色，其阳性率显示随细胞代龄的增加阳性率呈递增的趋势，见表3。对同批次细胞间阳性率的直线相关分析结果显示Ⅰ、Ⅱ批次细胞β半乳糖苷酶染色阳性率和细胞代龄之间分别呈极显著和显著相关，而Ⅲ批次细胞阳性率和代龄之间无显著相关性，见表4。Ⅰ批次细胞15代之前阳性率均<30%，28代之后均>50%，而Ⅱ批次细胞13代就达到了48.72%，Ⅲ批次细胞10代之前就已超过40%，说明不同批次间细胞生长状态不同，存在个体差异，老化速度不一致。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ批次细胞取材年龄分别为9、12、18岁，可以看出随着年龄的增长细胞活性逐渐降低。表4 成纤维细胞β半乳糖苷酶染色阳性率直线相关分析结果

　　3 讨论

　　成纤维细胞(fⅠbroblast)是皮肤真皮层中最重要的细胞，常附着在胶原纤维上，能合成和分泌大量胶原蛋白，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用[2]。目前，成纤维细胞主要应用于医学美容及组织工程产品中。医学美容多以直接注射细胞为手段，组织工程产品中成纤维细胞主要充当的是种子细胞的角色。

　　成纤维细胞系是通过原代、传代培养获得的，是有限细胞系，随着代龄的增加，细胞会逐渐出现衰老迹象。细胞衰老具有一些共同的生物学和分子特征。一个特征是染色体端粒的逐渐缩短，大量研究提示端粒不单记录着有丝分裂的次数，也是细胞衰老的标志，但是目前缺少有效测量端粒长度的手段[3]。 1995年Dimiri等[4]发现了一种与细胞衰老相关的β半乳糖苷酶(senescenceassocⅠated βgalactosidase,SAβGal)。他们发现体外培养人二倍体成纤维细胞在pH6时，β半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而增加，他们把这种中性β半乳糖苷酶定义为衰老相关的β半乳糖苷酶。目前，随着细胞培养技术的发展，已建立了多种皮肤成纤维细胞的培养方法[5]。本实验采用胶原酶消化法可获得数量巨大、纯度极高、状态良好、活性较高的成纤维细胞。在最初分离时，成纤维细胞中不可避免地混有部分角质形成细胞，随着不断传代，角质形成细胞逐渐被筛除，得到纯度极高的成纤维细胞。

　　成纤维细胞的特异性标志蛋白是波形蛋白。角质形成细胞的特异性蛋白为CK19，因此使用CK19作为阴性对照能够更好的筛选出成纤维细胞。

　　本实验对18个批次不同代龄(p1～p33)的细胞进行了免疫细胞化学检测，除3次阳性率低于100%以外其余均为100%，证明了我们获得的细胞确为纯度极高的成纤维细胞。3次低于100%阳性结果并非出现在低代龄，而是第11代左右，分析原因可能是由于操作原因造成了弱阳性结果，致使人为判断失误而导致的试验误差。实验为成纤维细胞系的鉴定提供了有效的方法，对成纤维细胞系的建立具有重要意义。

　　随着成纤维细胞体外培养代龄的增加，细胞的增殖能力逐渐降低，当不能再进行有丝分裂时，其生长达极限而成为衰老细胞。1995年Dimri等[4]首次提出了一种鉴别衰老细胞的标志酶-衰老相关β半乳糖苷酶。正常皮肤成纤维细胞体外培养时随着增殖能力的逐渐降低，β半乳糖苷酶阳性细胞的积累速度也加快。

　　本实验对不同批次不同代龄的细胞进行了β半乳糖苷酶染色。对同一批次细胞进行直线相关分析显示，随着代龄的增加阳性率总体呈现递增的趋势，两者之间存在显著相关性。对于Ⅲ批次细胞呈现不相关性是由于出现了不稳定点并且样本数量较少所致。对于不稳定点的出现，我们分析可能是由于孵育时染色液蒸发导致染色不充分，也可能是在细胞培养、传代时由于某些因素导致细胞状态不稳定所致。另外，通过对不同批次间细胞比较得出不同批细胞生长状态不同，老化速度不一致，个体间存在差异，年龄较小的材料更容易得到活力较高的细胞，由此建议取材年龄以10岁左右为宜。但这也并非绝对，个人体质的差异也可能影响细胞活力。

　　综上所述，β半乳糖苷酶染色法能够简单、快速的检测细胞老化过程，具有重要的生物学及临床意义。需要注意的是，该法也有一定的局限性，应该综合考虑各种生物学指标如DNA甲基化水平、端粒长度、线粒体DNA片断缺失等才能更准确的阐明细胞的衰老机制。

　　皮肤的中层主要由胶原蛋白构成，胶原蛋白形成皮肤支架，使皮肤具有弹性、光泽。成纤维细胞能合成和分泌大量胶原蛋白等多种细胞外基质，随着人的衰老，成纤维细胞数量减少，胶原蛋白分泌减少，造成皮肤中层萎缩，即会出现鱼尾纹、额头纹、鼻唇沟变深等。应用成纤维细胞进行美容除皱和创伤修复，可望在今后成为安全、有效、全新的医学修复方法。

　　本实验进行了成纤维细胞的鉴定和老化检测，为相关研究提供了简单、有效的方法，对成纤维细胞系的建立具有重要意义。

【参考文献】  　　1 杨志明主编.组织工程学.第1版.北京:化学工业出版社,2002.155158.

　　2 吴国平,周燕,谭文松,等.人皮肤成纤维细胞在二维和三维培养系统中的生长代谢特性.中国组织工程研究与临床康复,2007,11:7477.

　　3 蔡霞,张鹏,唐胜建,等.正常人成纤维细胞老化过程中β半乳糖苷酶的变化.解剖科学进展,2004,10:911.

　　4 Dimri GP, Lee XH, Basile G, et al.A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,1995, 92: 93639367.

　　5 马刚,王 胜,陈世义,等.皮肤成纤维细胞收缩功能的研究 .白求恩医科大学学报, 1996, 22: 272273.