大鼠肺放射性损伤的超微结构观察

作者          作者单位

肖桃元     第三军医大学,高原军事医学系中心实验室,重庆,400038

王久惠     第三军医大学,大坪医院野战外科研究所肿瘤中心,重庆,400042

陶忠芬     第三军医大学,高原军事医学系中心实验室,重庆,400038

韦　建     第三军医大学,大坪医院野战外科研究所肿瘤中心,重庆,400042

可金星     第三军医大学,高原军事医学系中心实验室,重庆,400038

李　涛     第三军医大学,大坪医院野战外科研究所肿瘤中心,重庆,400042

路　菊     第三军医大学,高原军事医学系中心实验室,重庆,400038

田　路     第三军医大学,大坪医院野战外科研究所肿瘤中心,重庆,400042

谭永红     四川省肿瘤医院内科,成都,610041

Ultrastructure of radiation-induced pulmonary injury in rats

XIAO Tao-yuan1,WANG Jiu-hui3,TAO Zhong-fen1,WEI Jian3,KE Jin-xing1,LITao3,LU Ju1,TIAN Lu3,TANYong-hong2(1Laboratory Center,College ofHigh AltitudeMilitaryMedicine,Chongqing 400038,2Oncology Center,Institute of SurgeryResearch,DapingHospital,Third MilitaryMedicalUniversity,Chongqing 400042;3Medical Department,OncologyHospital of SichuanProvince,Chengdu 610041,China)

Abstract:Objective　To investigate ultrastructural pathology and pathogenesis of radiation-inducedpulmonary injury.Methods　Sixty-three adultmale SD ratswere divided in three groups randomly,receivingirradiation atdose of10,20,and 30 Gray at their righthemithorax. The irradiated rats ofeach groupwere kill-ed at1,3,7,14,28,90,180 d,and their lungswere observed by lightand electronmicroscope. Another14rats served as normal contro.lResults　In early phase of irradiation-induced injury(1-30 d),we observedtypeⅠpneumocytes injury,increased and ctivatedmacrophages,the activation of typeⅡpneumocytes,thedamage and proliferation ofendothelial cells,the congregation ofplateletandRBC,thrombosis,and interstitialedema. In the fibrotic phase(60-180 d),therewere the abnormalproliferation of typeⅡpneumocytes,theproliferation of fibroblasts and collagens,the atrophy and depletion of capillary vessels,and finally lung fibrosis.Conclusion　The pathological changes in endothelial cells of capillary vessels,the disturbance of bloodcirculation and interstitial edema are the earlymajorpathological changes of irradiation-induced pulmonary inju-ry,whichmay be the primal factors responsible for the development of irradiation-induced lung fibrosis. Theprocess of lung fibrosis involves fibroblast activation,abnormal proliferation of typeⅡpneumocytes and ncreasedmacrophages,resulting from the combined effects of complex factors.

Key words:radiation injury;ultrapathology;lung;rat

胸/肺部肿瘤的放射治疗常常引起放射性肺损伤,临床通称放射性肺炎,损伤早期表现为肺泡炎性渗出水肿,结局是不同程度的肺纤维化,严重制约了肿瘤的放射治疗。虽然数十年来对本症研究甚多,但至目前为止对其发病机制仍不十分清楚,尚无有效防治措施,本研究通过大鼠肺放射损伤动物模型观察肺超微结构变化,探讨放射性肺炎和肺纤维化的发生机制,并为该病的防治提供理论基础。

1　材料与方法

1. 1　动物及分组

第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供健康SD雄性大鼠77只,体质量220~250 g,分实验组63只和正常对照组14只,实验组经30、20、10 Gy 3个剂量组一次性照射右半胸,左半胸作实验对照,照射后分7个时点(1、3、7、14、28、90、180 d)活杀动物,每时点每实验组3只,对照组2只,取右肺中叶及左肺下叶组织作光、电镜观察。

1. 2　致伤方式

动物用速眠新Ⅱ(1. 0 ml/kg)肌肉注射全身麻醉,仰面固定,经屏蔽,定位曝露右侧全胸,用8MV直线加速器照射(X射线),分30、20、10 Gy 3个剂量组一次性照射,对照组大鼠麻醉后佯装照射。

1. 3　实验观察

照射后按以上7个时点处死动物(快速断头),开胸取右肺中叶和左肺下叶固定于3%戊二醛,随后修小块(1 mm3大小)继续固定,按常规程序制作电镜超薄切片,在Philip-TECNAI-10电镜80 kV观察。余下组织转入10%福尔马林液固定,按常规程序制作石蜡切片,HE染色,光镜观察。

2　结果

2. 1　光镜观察结果

正常对照组:无明显病理改变。各实验组照射后24 h肺泡出现轻微充血,余无明显病理改变。照射3 d后直至4周,见点状/片状淤血,肺泡腔有液体及单个核细胞渗出(图1)。淤血范围随照射剂量高而增宽,更严重。照射后2个月后淤血水肿减轻,范围缩小,肺泡上皮增生,隔增厚,纤维化实变(图2),并逐渐增宽。病变程度与剂量相关。对照侧肺组织早期有充血改变,以后病变不明显。

图1　10 Gy照射后14 d,肺叶灶性淤血,伴液体及单个核细胞渗出　(HE×400)

图2　30 Gy照射后6个月,肺泡塌陷,纤维化实变　(HE×400)

2. 2　电镜观察结果

正常对照组无明显病理改变。

10 Gy组照射后24 h无明显病变,见Ⅱ型上皮细胞胞吐活跃,核周间隙、粗面内质网轻度扩张。照射后3 d,见内皮细胞增生、核增大及分裂像,有的拥塞管腔,肺泡隔间质局部液体渗出(图3),Ⅱ型上皮细胞核周间隙、粗面内质网、高尔基复合体囊泡扩张。照射后7 d,见局部Ⅰ型上皮细胞高度肿胀,细胞质苍白,有的细胞器破碎脱落;Ⅱ型上皮细胞数目增多,可见双核细胞,个别显轻微肿胀;多见肺泡隔毛细血管腔内血小板聚集,并见到分叶核和单核白细胞,内皮细胞仍见增生现象,可见内皮细胞与基底膜分离,局部肺泡隔高度水肿,挤压毛细血管壁向管腔内凸成大泡;肺泡腔内大量吞噬细胞。2周时,除上述病变外,见到肺泡隔成纤维细胞增生,双核细胞出现,单核、分叶核细胞浸润,Ⅰ型上皮细胞显肥胖、增厚、细胞器增多。4周时,肺泡隔局灶严重水肿仍存在,成纤维细胞和胶原增生。3、6个月时,肺泡腔塌陷,隔皱折,胶原增生,血管减少。仍可见到部分水肿区。图3　10 Gy照射后3 d增生肥大肺泡血管内皮细胞　(TEM×7 000)图4　30 Gy照射后3 d充血的肺泡隔毛细血管　x:血小板聚集;

↓:肺泡Ⅰ型上皮细胞剥脱破碎　(TEM×7 000)

20 Gy照射后24 h及3 d时,多见Ⅱ型上皮细胞排空空泡;血管内皮细胞增大,核大,核仁明显,细胞质内有肿胀空泡和破碎细胞器,管腔内多见细胞器破碎变性物及分叶核和单核白细胞; 7 d和14 d时,局部Ⅰ型上皮细胞破碎损伤,细胞器和裸核散落肺泡腔,吞噬细胞活跃;Ⅱ型上皮细胞核周间隙及粗面内质网扩张。肺泡壁血管扩张充血,管壁有破裂现象,血管腔内血小板聚集多见(图4);肺泡隔广泛严重水肿,挤压血管。至照射后4周仍能见到部分血管病变,肺泡隔水肿现象一直到3个月仍在局部见到。2周时成纤维细胞明显增生活跃,照射后4周有胶原形成, 2~3个月,肺泡隔严重纤维化增厚,血管减少(图5)。Ⅱ型上皮细胞肥大,可见到双核、三核细胞,嗜锇性小体集聚(图6)。

30 Gy照射后3 d即见肺泡隔毛细血管扩张充血,腔内堆积血小板和红细胞,中性粒细胞和单核细胞多见,并见到血管内皮破裂处,间质水肿,挤压血管,内皮与基膜剥脱,管壁向腔内凸起,凸起处切面成大泡状,这种状态在照射后7 d进一步加重(图7),同时内皮细胞增生,阻塞管腔,局部Ⅰ型上皮细胞剥脱,飘于肺泡腔中(图4),Ⅱ型上皮细胞肥大,核大,可见双核,嗜锇性小体聚集。14 d时,肺泡隔间质水肿仍然存在,大量成纤维细胞增生,核大异型,胶原增多。肺泡Ⅱ型上皮细胞显得增多。照射后4周,肺泡隔水肿和胶原增生相间,血管受压变形,成纤维细胞肥大如肌成纤维细胞,核肥大核仁显著(图8)。局部Ⅰ型上皮细肿胀呈空泡状。照射后3个月,肺泡隔严重胶原增生,纤维细胞成熟(瘢痕化),血管减少,细小。肥大细胞多见。6个月时,肺泡拥挤,腔塌陷,隔血管减少,胶原增生,Ⅱ型上皮细胞多见。

a:血管减少;*:胶原纤维增生、纤维化;N:三个核的Ⅱ型上皮细胞

图5　20 Gy照射90 d后的肺泡隔　(TEM×2 900)

图6　30 Gy照射90 d后的肺泡Ⅱ型上皮细胞　(TEM×4 200)

图7　30 Gy照射7 d后的肺泡隔间质　(TEM×7 000)

图8　30 Gy照射28 d后的肺泡隔成纤维细胞　(TEM×7 000)

3　讨论

近年对放射损伤机制的分子生物学研究较多,形态学方面研究较少,早年Adamson等[1]作过肺放射损伤的超微结构描述,以后描述不多,提出各种动物放射损伤超微病理有所不同,但基本病变相似[2, 3]。本研究以不同剂量一次性照射大鼠半胸动物模型,动态观察双肺超微病理变化,作了较为详细的描述,并对放射性肺损伤的发生机制作一些探讨,以期为该病的防治提供一点参考。

(1)本研究观察到肺泡Ⅰ型上皮细胞的损伤是明显的,与其他文献描述相似。20 Gy、30 Gy照射后3 d,10 Gy照射后1周见到肺泡Ⅰ型上皮细胞肿胀,破碎剥脱。30 Gy照射后1个月仍能见到肿胀的Ⅰ型上皮细胞。随之,肺泡腔内出现较多的吞噬细胞,且吞噬活跃。我们认为吞噬细胞活化和增多,是对细胞损伤破坏的反应,同时可能释放细胞因子和炎症介质参与刺激成纤维细胞增生和胶原分泌,是损伤早期启动肺纤维化的因素之一。

(2)肺泡Ⅱ型上皮细胞反应也较早,照射后24 h见到嗜锇颗粒脱失,细胞质内排空空泡。照射后3~7d见到肺泡Ⅱ型上皮细胞活跃,细胞肥大、核增大、核仁明显及粗面内质网增生、腔扩张,微绒毛丰富等。照射后24 h至3个月,大多能见到双核、三核的肺泡Ⅱ型上皮细胞,同时细胞增多。

有人认为肺泡Ⅱ型上皮细胞是辐射损伤的靶细胞,自始至终都存在损伤和功能异常[4]。从我们观察到的肺泡Ⅱ型上皮细胞表现,认为该细胞在放射早期被激活,表面活性物质释放增多,合成增加,这与W ill-ner等[5]观察到肺泡Ⅱ型上皮细胞的分泌增加相符合。以后一直表现为异常增殖,出现双核、三核Ⅱ型上皮细胞,细胞数也增多。我们知道,肺泡Ⅰ型上皮细胞易受损伤又无增殖能力,肺泡Ⅱ型上皮细胞则能增殖并分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞,因此认为肺泡Ⅱ型上皮细胞的表现是照射后的异常增殖,其分泌功能可能并未受到很大影响。因此所谓肺泡Ⅱ型上皮细胞是辐

射损伤的靶细胞的说法值得商酌。肺泡Ⅱ型上皮细胞的激活释放多种细胞因子参与激活胶原的分泌,促进纤维增生,也是参与肺纤维化的因素之一。

(3)肺泡隔血管及间质病变。光镜观察到照射后3 d,肺叶呈点/片状淤血。1个月后病变减轻缩小,代之肺泡实变、纤维化。电镜下观察到:血管内皮细胞病变出现最早,几个剂量组均在24 h见到内皮细胞核增大,细胞质肿胀,细胞器破碎,以后继续加重。照射后3 d见内皮细胞增生/肿胀,出现核分裂像。Novakova-Jiresova等[3]报道照射剂量低至9 Gy即出现血管病变,谭永红等[6]提到血管内皮细胞可能是辐射损伤最敏感的实质细胞,我们进一步提示由血管内皮细胞损伤引起一系列继发病变:表现为毛细血管腔内血小板拥塞,血栓形成,循环障碍,液体漏出,间质水肿。严重的间质水肿使血管壁与基底膜分离,同时炎细胞浸润,成纤维细胞增生,胶原逐渐增多,终至肺泡隔纤维化,血管萎缩、减少。

Fleckenstein等[7]最近研究提示,在众多因素中,放射早期血管病变导致的缺氧是一系列继发性肺损伤的主要始因,从本研究描述病变可以看出,肺泡隔血管内皮病变和血液循环障碍以至间质水肿是放射性肺损伤早期的主要病理变化。首先由内皮细胞损伤引起血小板粘集,内皮细胞反应性增生肿胀阻塞管腔,加重血小板和红细胞的凝集,血栓形成,导致血循环障碍、液体漏出、间质水肿,结果是肺泡缺氧,这是导致临床呼

吸衰竭的病理基础。肺泡缺氧的持续刺激,以及微血栓的机化,刺激成纤维细胞和胶原增生,致使血管闭塞、萎缩、减少,最终肺泡隔纤维化。类似病变在其他原因(如缺氧、感染、SARS…)引起的肺血液循环障碍/肺水肿也见到,肺纤维化是同样的结局。因此我们认为针对早期内皮细胞损伤及血液循环障碍采取适当防治措施,是从起始端阻止肺纤维化的发展[8]。

另外在其他部位,如鼻/鼻咽/咽部、乳腺等肿瘤的放射治疗中,电离辐射引起间质成纤维细胞激活,表现为间质假肉瘤样增生,以及后期胶原化[9, 10],那么,在肺照射时,电离辐射本身对成纤维细胞的激活,也是肺纤维化进程的重要因素。

综上所述,肺血液循环障碍及多种细胞参与肺纤维化的发生过程,那么多种因素如何相互作用是近年研究的热门话题。

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