应用双向差异凝胶电泳和质谱技术筛选胰腺癌血清早期诊断标志物

　　胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,近年来其发病率在全球范围内呈明显L升趋势,已经成为美国和欧洲国家第四位或第五位肿瘤致死原因[⒈2]。　　在我国,1991-⒛00年胰腺癌病死率水平不断上升,在肿瘤致死原因中一直位居第七位或第八位。　　有研究[4]表明,胰腺癌和其他肿瘤一样,发展很慢,有很长的时间可用于早期诊断。但是由于胰腺癌解剖位置深在,早期症状隐匿,因此确诊率低,⒛%~⒇%的患者在确诊时就已经出现病灶转移,失去手术机会,胰腺癌预后极差,5年生存率不足5%156」。现有的肿瘤标志物缺乏特异性和敏感性,囚此寻找更为有效的胰腺癌肿瘤标志物成为目前的研究热点。近年来,蛋白质组学发展迅速,已经广泛应用于临床研究,特别是胰腺癌肿瘤标志物的研究[7]。　　本研究应用比较蛋白质组学方法鉴定胰腺癌患者外周血中的差异表达蛋白,以期找到理想的胰腺癌血清早期诊断标志物。　　1资料与方法　　1.1资料　　收集安徽医科大学附属省立医院普外科2009年5月一2011年4月经病理证实的胰腺癌患者血清标本40例,年龄(60.0±12.2)岁,所有标本均为术前采J血,且术前均未进行放、化疗。胰腺良性肿瘤10例,年龄(45,0±17.4)岁。慢性胰腺炎患者血清标本10例,年龄(53.4±I20)岁c安徽医科大学附属省立医院健康体检中心健康体检者血清标本硐例,年龄(40,0±8.9)岁。各组的男女性别比均为⒊2。各组在性别、年龄等方面差异无统计学意义(P>0.05)c12试剂和仪器溴酚蓝、尿素、亚甲双丙烯酰胺(美国BioRad公司);硫脲、双向凝胶电泳标准蛋白质、琼脂糖、过硫酸铵(Amm。血umpe茹ulhte,AP)、丙烯酞胺、甘氨酸、四甲基二乙胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、表面活性剂(去垢剂)(CHAPS)、碳酸氢铵(NHZIH∞3)、三氟乙酸(TFA)、乙腈(美国⒊gmaⅢd五ch公司);二硫苏糖醇(DTΓ)、碘乙酰胺、两性电解质(Phamalyte,pH3~10)、覆盖液(瑞典AmcrshamB0qcienccs公司),氰基4-羟基-肉桂酸、胰蛋白酶(德国⒊gma公司)、乙醇(天津化学试剂厂);CyDr青花素荧光染料(C`、ClT3、Cy5)(美国GE公司);⒛cm固相pH梯度(Imm。bil-heclpHga曲ellt,IPG)干胶条(pH3~10非线性)(瑞典AmαshmB汛cicnccs公司)。　　IPGphorⅡ等电聚焦仪(美国BoRaa公司);Ettan~DALTtllTe1Ve电泳系统(美国BioRad公司);Typ11pon9000系列多功能激光扫描成像系统(美国B⒗Rad公司);凝胶成像分析系统(中国江苏捷达科技发展有限公司);蛋白定量仪SmarsperPlus;MAL-DI-TOF-TOF质谱仪4800(美国ABI公司);Decyder差异分析软件(美国GE公司);电泳槽、电转仪(美国BoRad公司)。　　1.3实验方法　　1.3.1血清样本预处理采集各组空腹外周静脉血5mL,4℃静置1h,在4℃下3OO01·/lllln(离心半径13.5⑾1)离心10min,分装血清100uL,置于-80℃冰箱保存各用。　　1.3.2样本制备将去除保存液的柱子放人EP管中,加入处理好的100uL样本液,冰上静置5m血,800g离心30s,收集洗脱液,加入100uLBh山ngBLlfI。r,换新的EP管,SO0g离心30s,收集洗脱液,再次加入100uLBincllBuffer,换新的EP管,⒛0g离心30s,收集洗脱液,将上述3次收集的洗脱液合并除盐浓缩后定量待用。　　1.3.3染料标记及双向电泳每组样品各取50ug用”DrDIGE染料/lr5分别标记(4OOpmd染料:50昭蛋白裂解液1uL,pH8·0~90),每组样品重复3次,内标(各组样品的混合液)用Cy2标记。　　4℃下标记反应30min后,用IPG胶条进行第一向等电聚焦,条件如表1,总电压时间乘积为⒇kⅤh。等电聚焦后将IPG胶条转移至12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上端⒒tdl-DALTtsvelve垂直电泳槽上进行第二向垂直电泳。电泳结束后采用改良的快速银染法进行蛋白质染色。　　1.3.4质谱鉴定用TyphoollQO00系列多功能激光扫描成像系统扫描双向电泳凝胶,其中荧光染料C`的激发光和发射波长分别为480nm和530nm;荧光染料Cy3的激发光和发射波长分别为~。^00nm和590nm;荧光染料Cy5的激发光和发射波长分别为69Onm和680nm。扫描后的图像文件用D乩lrdσ差异分析软件分析,对每一张胶图上的所有蛋白点扫描进行胶内分析(Ⅱ犰re11haIin-莎lanaly“s,ElIA),然后对不同胶上的同一蛋白点与内标匹配,进行胶间分析(Biolo驴cal妃nau。narldy0s,BⅤA)。对差异蛋白点进行MALDI~TOF~MS分析。　　1.3.5数据库检索将各蛋白的二级肽段质谱图用Mascot搜索引(http//w、ˇ飞v,mat1ixscicnce.com)在SwissPlot数据库进行查询。　　1.4统计学方法　　数据采用sPS130统计软件进行分析。不同组问采用r检验进行比较。本实验设定大于等于1.5倍为差异点。蛋白表达量以正值表示蛋白表达升高,负值表示蛋白表达降低。P(0.05“认为差异有统计学意义。　　2结果　　2.12DˉDIGE分离蛋白质结果　　分别用不同波长的激光对每块胶上进行扫描,获得不同扫描图。对各组胶上的同一蛋白点与内标匹配,进行胶间分析,通过计算机软件设定好参数(l。5倍差异点显示),得到各组间比较1.5倍差异蛋白点图谱(见封三,图1)。　　2.2MALDIˉTOF~MS蛋白质鉴定结果　　成功鉴定3个差异表达蛋白:血色素结合蛋白(Hemopexin,Hpx)、人纤维凝胶蛋白3(Flcohn3,FCN3)和血清淀粉样蛋白P成分(Semmamyl。dR∞mponcnt,SAP)。　　该组蛋白在胰腺癌组中呈高表达,在胰腺良性肿瘤组、慢性胰腺炎组和正常对照组中呈低表达(表2和封三,图2~4)。各点胰腺癌组表达分别较正常组高表达1“倍(P<0.O~,)。　　3讨论　　胰腺癌是一种多基因参与的复杂疾病。其基因的表达分析涉及基因组及蛋白质组学方法。由于蛋白质的表达在转录与翻译间由多点调控,转录的mRNA丰度与翻译的蛋白质数童间相关不明显,因此用蛋白质组学方法从整体上研究胰腺癌的发病机制,寻找胰腺癌早期诊断特异性标志物十分有必要。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assistodlaserdcsorption/ionizatlontimeofⅡightmassspectromc,MALDI-T0阝MS)是一种软电离技术,并可分析生物分子间的相互作用。其测量的相对分子质量范围较大()笱kD),操作简便,灵敏度可达血d的水平,因此已经广泛应用于胰腺癌肿瘤标志物的筛选研究。　　本实验联合应用了2D-DIGE和MALDI-TOFMs技术分析了胰腺癌患者、胰腺良性肿瘤患者、慢性胰腺炎患者和正常人群外周血清中蛋白质的表达情况。经DcClTdcr差异分析软件分析胰腺癌患者和正常人群血清,发现有H6个显著差异蛋白点,其中35个蛋白点上调大于1.5倍差异倍数,81个蛋白点低表达。成功分离并鉴定出3种差异表达蛋白质:Hpx、FCN3和SAP。该组蛋白在胰腺癌组中呈高表达,在胰腺良性肿瘤组、慢性胰腺炎组和正常对照组中呈低表达。　　Hpx是存在于人血清中的β1糖蛋白(60kD),对血红素有很高亲和力,是肝脏吸收和降解ml红素所必需的蛋白「nl。　　有文献报道,Hpx在肝癌、乳腺癌、肺癌患者血清中有不同程度的表达。本研究结果显示,Hl,x在胰腺癌患者中高表达,在对照组低表达,均提示其与肿瘤的发生、发展有密切联系。FCN3虽然在免疫反应中与补体激活有关,但是也有学者研究表明FCN3与前列腺癌进展有关,Atlclelsen等用2D-DIGE和质谱技术对ω例卵巢癌患者和∞例正常人血清进行分析,结果显示,FCN3在卵巢癌组高表达,在正常组低表达,提示FCN3与卵巢癌发生、发展有关,可能是一种潜在的卵巢癌标志物。本研究结果显示,FCN3在胰腺癌患者中高表达,在对照组低表达,提示其与胰腺癌的发展有关。　　SAP通过C矿+依赖性方式可以与多种配体结合,包括C反应蛋白、补体等。Κolstc,c等[19]报道SAP与阿尔茨海默病有密切关系。h等[20]利用MALDI-QIT-TOF-MS技术对2例胰腺癌患者、37例糖尿病患者、35例慢性胰腺炎患者和89例正常人的血清进行分析,结果显示,sAP在胰腺癌组高表达,其他组低表达,有可能成为胰腺癌诊断标志物。　　本研究结果与前人研究结果相一致,提示应用2D-D⒑E技术联合MALDF~TOF~MS技术筛选胰腺癌患者外周血清中的特异性生物标志物的方法具有较好的重复性和稳定性c本研究所发现的3种蛋白在胰腺癌患者与正常人群血清中表达差异显著,提示其与胰腺癌的发生发展密切相关,可能是胰腺癌早期诊断的标志物。　　参考文献　　Jemal A,Siegel R,Xu J. 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