mir-520c-3p靶向GPC3对肝癌Huh-7细胞增生、迁移和侵袭能力的影响的研究

　　磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(αypican3,GPC3)是一种膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白,研究表明,GPC3在肝细胞癌(Hepatocellularcarcilloma,HCC)中有特异性高表达,而在癌旁组织、肝硬化、肝炎组织、成人正常肝组织低表达或不表达[⒈2],被认为与HCC的发生、发展密切相关,并能影响多种生物效应分子。　　miRNAs是近年来发现的一类长度为18~叫个核苷酸的非编码小分子RNA,主要通过与靶标基因3′UTR的完全或不完全配对,降解靶标基因mRNA或抑制其翻译,从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增生及分化等生命活动5∶。实验表明miRNAs可通过调控其靶标基因参与的信号通路,影响肿瘤的发生和发展,发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能:6∶。已发现若干miRNAs直接参与肝细胞癌的发生和发展,miRNAs表达谱与肝细胞癌的诊断、分期、进展和预后等相关。本文通过研究m⒈52oc-3p靶向GPC3后对肝癌HLlll-7细胞增生、侵袭和迁移能力的影响。　　1材料与方法　　1.1实验分组及方法　　将实验组分为三组:未转染mir~520c-3p的Httll刁细胞组(ce11组),阴性对照组(NC组)及转染mir~520c¨3p的Huh刁细胞组(干扰组)。然后利用荧光定量PCR和WesternBlotting分别检测三组GPC3基因的mRNA和蛋白的表达量,通过EDU检测细胞增生的变化,通过T1。answell检测细胞侵袭和迁移能力的改变。　　1.2细胞培养与转染　　人肝癌细胞株Huh~7用含10%胎牛血清的高糖DMEM(⒍bco-BRL)培养液,置于37℃、含5%C02的细胞培养箱内培养,使细胞汇合度为⒛%~80%;用胰酶消化、传代。转染步骤参考lipo兔ctami"⒛00说明书进行,转染后72h进行后续检测。而r-5⒛c-3p血mics购自上海吉玛生物公司,终浓度均为50nM。　　1.3荧光定量PCR检测　　收集细胞后用T1。izol提取总RNA,PLT反应步骤为：　　1.3.1RAN提取在RNaseⅡcc的PCR管中配置下列溶液(TotalRNA1.0昭;H2012uL,总体积12uL);将上述溶液吹打均置“℃保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷,以防止RNA复性。　　1.3.2反转录合成cDNA在PCR管中加人下列试剂(Plomcga),配制反转录反应液:Clli⒛(dT)Rantlom05uL、PⅡmer0.5uL、10mMdNTP2.0uL、RNaseinhibitor0.5uL、5×buffcr4.0uL不口M-MLⅤ0.5uL,将上述9OuL反应溶液30℃保温10而n;鳇℃保温0Omin;80℃保温10血n。　　1.3.3设计的引物qr~GPC3mRNA的特异引物正义链F:5′AGAAACCTTATCCAGCCGAAGAA3′;反义链R:5′TGGGTCCAACTACTAAGCT3′1.3.4反应体系cDNA(1:20)5,0uL、上游引物05uL、下游引物0.5uL、2×SYBRC∞enPCRM灬-抬rMix10uL禾口dH204.0uLo1.3.5反应条件呖℃5mh,95℃15s,进行硐个循环,ω℃15s,72℃32s读板;融解曲线分析:温度每个样重复3次。　　1.3.6荧光定量PCR以U6小核RNA(U6small nuclearRNA,U6sllRNA)为检测miRN热的内参照,检测成熟而RNAs的引物购自Amht,li公司。同时,用ol-圯odT引物进行逆转录,SYBR-⒍een染料法(SYBR⒍eenPCRMastcrMk购自TOYOB0)进行定量检测GPC3,GPC3所用引物为:has~洫s-520c-3p序列5′AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU3′;qr-GPC3mRNA的特异引物:正义链F:5′AGAAACC"ATCCAGC-CGAAGA3′;压Lst钣奎R:5′TGGGTCCAACTACTAAGCT3′;内参GAPDH的特异引物:正义链F:5′Gg队TCGTG~GAAGGACTC3′;反义链-R:5′GTAGAGGCAGGGAT-GAT∞′;内参为⒍ΨDH(基因号为NMJ02⒁6),反应条件为:%℃5m血;95℃~sOs,甾℃~sOs,”℃~sOs,硐个循环,实验重复3次,定量分析通过比较2-ΔΔα值进行。　　1.4WesternBIOtting　　细胞收集后用PBS洗涤2次,加入RIPA缓冲液(1ⅩPBS,1%NP-40,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS),5mMEDTA,0,5%脱氧胆酸钠,1mM原钒酸钠)和蛋白酶抑制剂裂解细胞。蛋白样品用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce)定量后,于8%SDS-PAGE上进行分离,并电转至PⅤDF膜上,用5%脱脂奶粉溶液进行封闭。加入稀释到合适浓度的,mti~GPC3和anh~GAPDH一抗,于4℃孵育过夜进行免疫杂交。然后加人共轭辣根过氧化物酶(HclrseradibhPcr-o虹cla⒃Cclllju叩te)的抗兔二抗,最后加入化学发光检0“),具有统计学意义(见封三,图4)测底物进行反应,显影检测。　　1.5Edu检细月包土曾生培养细胞到汇合度达80%左右时,按EdUAl1(锐博)说叫书每孔加入100uL50uMEDU培养基孵育211;弃培养液,每孔加入100uL细胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育I5~30血n,再加人2m酽mI,甘氨酸孵育10mi11;PBs冲洗,每孑L加入100uL渗透剂(含05%Thk汀1Ⅹ~100的PBS)透化细胞;加人100uL的1ⅩAlDollo⑧染色反应液,避光、室温孵育30nlin;加人100pI.1ⅩHoechst33342反应液,避光、室温孵育10~30min;洗脱Ho∝hsB3342反应液,荧光显微镜观察。　　1.6transwe1I法检测细胞侵袭和迁移能力的变化往answell小室中铺上人工基底膜(Matll跗l),细胞转染后第2天进行悬浮,调整细胞密度至I×106个细胞/n1L,取⒛0uI氵加入Tt·an哪dl小室上室,在下室加人∞0uL完全培养基;37℃、5%C孵育48h后,4%多聚甲醛固定15min,PBS洗涤1次,结晶紫染色10mlll,I)BS洗涤1次,拍照计数分析:　　2统计学处理　　采用叩SS17.0统计软件进行处理,计量资料以均数±标准差(元±s)表示c检测体外细胞增生能力、侵袭迁移能力、荧光定量PCR和免疫蛋白印迹检测实验采用单冈素方差分析(one~wayAN0ⅤA)比较各组间差异。P<0.05“表示有统计学意义,P<0.01为有显著性统计学意义.所有实验至少重复3次:　　3结果　　3.1合成血r~520cˉ3pˉ血mics后转染到Huh~7细胞荧光定量检测显示cell组、NC组和干扰组mRNA水平分别为l,13±0。⒛、l⒛±0.15和1Ob^±0,19(P>005),无统计学意义,血r520c-3p不影响GPC3mRNA转录水平(图1),而WestcrnP,lotong检测显示mir~520c-3p明显降低GPC3蛋白表达水平,∞ll组、NC组和干扰组分别为2.16±0.调、1∞±0。⒁和0.499±0.“(P(0.01),与对照相比具有显著统计学意义,这说明mir~520c¨3p靶向GPC3基因,不影响其转录前水平,而是通过降解或抑制其mRNA影响转录后的翻译水平,导致翻译蛋白显著减少(图2、3)。　　3.2转染雨r~5⒛cˉ3p后抑制肝癌Hull~7细胞的增生EDU检测(×100)结果表明,重组真核表达质粒构建m⒈52oc-3p一血而cs瞬时转染Htlh-7细胞后,转染组细胞生长缓慢,而对照组细胞的生长明显快于实验组,cell组、NC组和干扰组分别为(90。⒓±1.93)%、(91.02±0.35)%和(77.73±5.88)%(P<0.05),具有统计学意义(见封三,图4)3.3转染mir~b^90c~3p后明显抑制肝癌Huh¨7细胞的侵袭能力"answelI检测(结晶紫染色,×⒛0)实验结果显不:mir-520c~3pˉmimics瞬时转染Huh~7细胞后,其侵袭能力明显受抑制,cell组、NC组和干扰组分别为0,071±O。oo8、0.105±0,001禾口0.048±0002(P(0.05),具有显著的统计学意义(见封三,图5)c3.4转染mir~显0c~3p后明显抑制肝癌Huh~7细胞的迁移能力△answcll检测(结晶紫染色,×⒛0)实验结果显不:m⒈520c~3pˉllllmiCs瞬时转染Huh~7后,细胞迁移能力明显受抑制,与对照组相比具有明显的统计学意义,其中∞ll组、NC组和干扰组分别为0y6±0.010、0.328±00o2和0.151±0.0O2(见封三,图6,P<001)c4讨论磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(g1y∮mn3,GPC3)是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白(H∞盯ansulfatcplotco型ycan,H叩G),与HCC发生发展的关系十分密切,不仅在HCC的早期检出率较高,并且随着HCC的发展进程,到中晚期其检出率也随着增高。GP∞在胚胎和胎儿期的肝组织细胞中呈高表达状态,而出生后随着生长其表达逐渐下降,到正常成人则呈低表达状态,与癌胚基因极为相似。1997年Hsu等[7]应用DDRT~PCR禾口Nolthernb1ot杂交发Imt191例HCC仁肀,1绍例(74,8%)可检测到GPC3n1RNA表达,而在正常肝脏和肝炎组织中GPC3mRNA检出率只有32%。　　Llbhccllt等研究发现,GPα在小肝癌的表达水平显著高于肝硬化及其他小局灶性病变,且发现GPC3染色阳性在小肝癌诊断中的敏感度和特异度分别为0。刀和0,%,提示GPC3在小局灶性病变的组织病理学诊断方面具有较大的临床辅助价值。之前我们研究L9∶发现:肝癌组织中GPC3阳性表达率为81.5%,而在癌旁及远肝癌组织则低表达或无表达,常成人组织细胞则几乎无表达。GPC-3是一种新发现的与肝细胞癌相关的基因,并参与肝细胞癌发生发展的调控过程。　　最近的研究[m"l表明,大约70%的哺乳动物miRNA基因是位于转录单位区(ptionu血ts,T1Js),且其中大部分是位于内含子区D据研究:∶发现MiRNA调节人类1/3的基因,参与生命过程的一系列重要进程,包括早期发育以及细胞增生、分化、凋亡、死亡和脂肪代谢,还可能具有癌基因和抑癌基因的作用,表现为不同类型的肿瘤有其特异的血⒒NA表达谱,可以与靶mRNA分子的3′端非编码区(3′UTR)互补结合,以二种形式:(1)与靶mRN际的3′UTR非翻译区的碱基不完全配对结合抑制蛋白质的合成;(2)严格完全互补配对结合到mRNAs,导致靶mRN热的剪切;(3)是最近才发现的一种方式,即miRNA会指导其靶向基因的mRNA快速脱腺苷化,进而导致mRNA的快速衰减和表达水平的降低,进而抑制蛋白质合成。那就是说,洫RNAs的下调意味着其靶基囚的表达上调,反之,血RNAs的上调可能说明靶基囚的表达受到抑制,故肿瘤相关miRNAs具有癌基因和抑癌基因的作用,它与肿瘤的发生、病理分级、临床分期、耐药性及预后等密切相关[14]。　　在HCC中表达上调的miRNA日前已有多个血RNAs被不同的研究发现在HCC组织中表达明显上调[16],这些高表达的miRN虬在HCC的发生发展中充当着类似癌基因的作用,被称为肿瘤miRNA。在肝癌中表达下调的miRN虬在肿瘤的发生发展中也有着充当类似抑癌基囚的作用[⒖]。⒕tlo凶kawa等t16J运用印迹杂交法发现,GPC3mRNA在55.7%HCC病例中表达上调,并应用自各的单克隆抗GPC3抗体检测发现,GP∞蛋白在6种肝癌细胞系(Hepα、HelD3B、HT17、HuH6、HuH7和PLCPPR「5)中表达过度,故认为GPC3与肝癌的发生发展机制有关。　　此外我们研究:还发现在HCCBe17402,SMMC7721,MHCC97L,MHCC97H,HcpC2,Huh-7LM3中,HLlh-7细胞为表达GPC3最高的细胞株。我们之前的预实验(未发表过数据)研究发现能够与GPC3基因3′UTR结合从而沉默GPC3的评价很高的==碧胬MicltlRNA(mir~2o2、mir~1271禾口111ir-520c-3p)中,mir~5⒛c~3p与GPC3基因3′UTR配对率最高,沉默GPC3基因效果最好;双荧光素酶检测发现,mi5⒛c-3p在GPC3基因的3′UTR确实存在匹配位点,从而证明GP∞是mir¨520c-3p的靶基因之一。故本实验选择高表达GPC3的细胞株Huh~7和沉默GPC3基因效果最好的llllr-520c-3p进行研究。笔者利用荧光定量PCR验证实验显示,lnir-5⒛c-3p不影响GPC3mRNA转录水平,但是WcsternBlotⅡng检测表明mir~520c3p明显降低GPC3蛋白表达水平,与对照相比具有显著性。这说明mir~520c-3p靶向GPC3基囚与其3′UTR结合,对其转录前水平不影响、不降解转录后的mRNA水平而只抑制其翻译过程,导致翻译蛋白明显减少j通过EDU实验检测发现HtLl·7转染mh、520c3pˉllllllllCs沉默GPC3后,实验组细胞生长受限,增生缓慢,而对照组细胞的生长增生明显快于实验组,由此可知沉默肝癌细胞GPC3基因后可抑制其生长增生,此发现可为临床上治疗肝细胞癌提供了新的靶基因位点,同时表明mir~520c-3p具有抑制肝癌细胞生长的作用,为肝癌的基因治疗提供了新的理论依据。transwcll检测实验结果显示:将m⒒~520c3pˉ血而cs转染Hu117细胞后,其侵袭能力显著降低;同时其迁移能力也明显受抑制,这表明,m⒈5⒛c-3p通过负调节GPC3表达能够有效抑制肝癌细胞的人侵能力。本研究证实GPC3对细胞增生的影响,并证实了抑制GP∞基因可以显著降低Httll-7细胞的增生能力。而我们对于mir~520c-3p的表达检测发现,相对于正常人肝细胞,耐r5⒛c-3p在肝癌细胞中的表达呈普遍下降,这说明m】52oc3p在肝癌中的表达与GPC3的蛋白水平呈负相关,llllr-5⒛C-3p能够抑制肝癌细胞的增生和人侵行为。GPC3是一个重要的具有调节HCC作用致癌基因,提示可作为一个潜在的治疗HCC的新靶点。　　本研究表明,血r520c-3p可能通过结合GPC3基因3′UTR而抑制GPC3的蛋白翻译,沉默GPC3功能,从而使肝癌细胞的生长增生速度降低,同时有效抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力,降低其入侵行为。　　参考文献　　Lim LP,Glasner ME,Yekta S. Vertebrate microRNA genes[J].Science,2003.1540.　　Houbaviy HB,Murray MF,Sharp PA. Embryonic stem cellspecific MicroRNAs[J].Developmental Cell,2003.351-358.　　Jovanovic M,Hengartner MO. miRNAs and apoptosis:RNAs to die for[J].Oncogene,2006,(46):6176-6187.doi:10.1038/sj.onc.1209912.　　Lee Y,Kim M,Han J. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase Ⅱ[J].EMBO Journal,2004,(20):4051-4060.　　Nakatsura T,Yoshitake Y,Senju S. Glypican-3,over expressed specifically in human hepatocellular carcinoma,is a novel tumor marker[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2003,(01):16-25.doi:10.1016/S0006-291X(03)00908-2.　　Zhu ZW,Friess H,Wang L. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders[J].Gut,2001,(04):558-564.　　Hsu HC,Cheng W,Lai PL. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma:biological significance and temporospatial distribution[J].Cancer Research,1997,(22):5179-5184.　　Libbrecht L,Severi T,Cassiman D. Glypican-3 expression distinguishes small hepatocellular carcinomas from cirrhosis,dysplastic nodules,and focal nodular hyperplasia like nodules[J].American Journal of Surgical Pathology,2006,(11):1405-1411.doi:10.1097/01.pas.0000213323.97294.9a.