高尔基体蛋白73原核表达系统的构建及单克隆抗体的制备

　　原发性肝癌(primaryhepaticcancer,PHC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率在恶性肿瘤中位居世界第五位，死亡率位居第三位。目前甲胎蛋白(AFP)仍然是临床上应用最广泛的肝癌血清标志物，但AFP作为早期肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)监测工具，灵敏度和特异性均不能满足临床需求。近年来针对肝癌的肿瘤标志物方面的研究很多，有报道发现高尔基体蛋白73(Golgiprotein73,GP73)的高表达与肝脏疾病有一定的相关性，尤其与HCC关系密切，可能成为早期诊断的标志物，同时与肝癌的治疗与预后判断也存在一定的相关性。　　我们拟在体外表达GP73的全基因序列，并制备单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb)，为今后的GP73用于相关疾病的诊断和治疗奠定基础。　　1 材料与方法　　1.1主要材料人肝癌细胞系HepG2细胞、原核表达载体pQE31,E.coliBL21、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为本实验室保存。T4DNA连接酶、BamHI和Hand}[[购自美国NEB公司，RneasyMiniKit,OneStepRT-PCRKit、Pl.asmidplusKit,Ni一NTASpinKit均购自德国Qiagen公司，IPTG购自美国Promega公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、小鼠单抗Ig亚类测定试剂盒、DAB,PVDF膜购自美国Sigma公司。引物合成及序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。常规化学试剂为国产分析纯级。20只雌性8周龄BALB/c小鼠由本院实验动物中心提供。　　1.2方法　　1.2.1GP73基因的获得、克隆、表达及重组蛋白的纯化:GP73阅读框架全长基因的获得与纯化:根据GP73GenBank公布序列(NM_177937.2)的ORF，设计上游引物:5'CCGGG.ATCCATGGGCTTGGGAAACGG3'，下游引物:5'CCCf1AGCTTTC.AGAGTGTATGATTCC3';其中_[、下游引物分别引人BamHI和HindIII酶切位点序列，并插人保护碱基。按照各个试剂盒说明书进行如下操作:提取HepG2细胞的RNA，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)(退火温度550C,35个循环)，PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收纯化。　　1.2.2原核表达体系的构建与鉴定:PCR产物和原核表达载体pQE31，同时应用BamHI和HindIII,分别进行双酶切并纯化;按照PCR产物/载体3:1的摩尔比，加人T4DNA连接酶16℃下连接16h，将连接产物转化BL21感受态细菌;挑取单菌落培养过夜后提取质粒，双酶切鉴定后，进行序列测定;序列分析正确后，将单菌落接种于含氨节霉素的LB培养液中，培养至摇振细菌生长至对数期后。约为0.6，加人IPTG使终浓度为1mmol/L的，37℃诱导表达5h;离心收集菌体，超声破碎菌体，再离心后收集上清液，按Ni-NTASpin试剂盒说明书进行重组蛋白的纯化;10%SDS-PAGE电泳分析。　　1.3动物免疫、杂交瘤细胞株筛选和单克隆抗体的制备与鉴定小鼠免疫:以重组蛋白为抗原，首次免疫与等量福氏完全佐剂混匀，完全乳化后注人BALB/c小鼠腹腔(40p,g/只),14d后再次以同样方法和剂量免疫，而后每间隔14d加强免疫1次，共3次(25wg/只)。末次加强免疫7d后，小鼠眼内毗静脉取血，通过斑点免疫印迹法检测抗体效价，选择高免疫效价的小鼠于末次加强免疫20d后准备进行细胞融合，融合前3d用80p,g/只(无佐剂)的抗原剂量冲击免疫1次。　　1.4细胞融合及杂交瘤细胞筛选按常规方法进行，杂交瘤细胞的筛选及制备的腹水用ELISA方法进行测定。　　1.5单抗特异性鉴定将诱导表达后的重组菌进行SDS-PAGE电泳后，将凝胶切割，一部分用作考马斯亮蓝染色，另一部分转移至PVDF膜，用2%BSA4℃封闭过夜;将PVDF膜按泳道剪成条带，分别与杂交瘤细胞上清和SP2/0细胞上清进行WesternBlot试验鉴定mAbs的特异性。　　1.6单抗Ig亚类鉴定按试剂盒操作说明进行。　　2结果　　2.1GP73基因的扩增、重组质粒鉴定及序列测定RT-PCR扩增产物在琼脂糖胶电泳中显示出约1200by的条带，与预期结果一致。质粒构建完成后，用BamHI和Hind进行双酶切鉴定，产物电泳显示，分别在1200和3500by左右可见酶切片段，与预期结果一致(见图1)。序列测定结果与公布序列比对同源性100%。　　2.2目的蛋白的诱导、表达与纯化重组质粒经表达和Ni+柱纯化后，SDS-PAGE电泳呈现单一的蛋白条带，大小约为45.2x103，与计算值大小一致。　　2.3杂交瘤细胞株的建立按常规方法，应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠，进行细胞融合后，再用ELISA方法进行筛选，共检测到11株融合细胞A值较高，用有限稀释法连续亚克隆4次，最终获得了5株分泌特异性GP73mAb的杂交瘤细胞株。经体外连续传代培养，液氮冻存6个月，复苏后仍生长良好，说明其分泌mAb的稳定性良好。　　2.4mAb亚类及效价鉴定5株单抗有2株为IgGI亚类抗体，1株为IgM;ELISA测定2株腹水最终效价均为1:5120和1:4096002.5mAb特异性的鉴定通过WesternBlot对单抗进行鉴定，在45x10，处可见特异结合带(图2)。　　3讨论　　GP73又称B型高尔基体膜蛋白(GOLPH2)，在各种肝脏疾病中均可能出现高表达，尤其在肝癌患者当中表达明显升高。在肝癌诊断中其灵敏度较AFP更高，有可能成为早期肝癌的血清标志物〔6]0我们根据GP73的公布序列，设计合成了引物，通过RT-PCR的方法分离了其全基因序列，并通过分子生物学的方法，构建了原核表达体系，获得了GP73的重组蛋白;随后又通过经典的方法，用重组蛋白免疫小鼠、融合筛选杂交瘤细胞，最终获得的11株单抗，进一步鉴定表明该5株细胞能够稳定地分泌GP73单抗，并且其中2株为IgGl型球蛋白，WesternBlot实验表明这2株mAbs具有良好的特异性。本研究获得的GP73重组蛋白和单克隆抗体将为今后的相关研究奠定基础。　　4参考文献　　Shariff MI,Cox IJ,Gomaa AI. Hepatocellular carcinoma:current trends in worldwide epidemiology,risk factors,diagnosis and therapeutics[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol,2009.353-367.　　Masuzaki R,Karp SJ,Omata M. New serum markers of hepatocellular carcinoma[J].{H}Seminars in Oncology,2012.434-439.　　Zhou Y,Yin X,Ying J. Golgi protein 73 versus alphafetoprotein as a biomarker for hepatocellular carcinoma:a diagnostic meta-analysis[J].{H}BMC Cancer,2012.12:17.　　J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔,黄培堂. 分子克隆实验指南,第3版[M].{H}北京:科学出版社,2002.　　朱立平,陈学清. 免疫学常用实验方法[M].{H}北京:人民军医出版社,2000.　　Ozkan H,Erdal H,Tutkak H. Diagnostic and prognostic validity of Golgi protein 73 in hepatocellular carcinoma[J].{H}DIGESTION,2011.83-88.