Lxn,bcl-2,c-myc在胰腺癌干细胞中的表达及意义

本研究通过免疫磁珠分选技术分选出胰腺癌细胞株 Miapaca-2中 的 CD133+细胞,并检测Lxn,bcl-2,c-myc在 CD133+与CD133-细胞中表达,探 讨其可能 的生物学意义。

材料与方法

1主 要 试 剂:免疫磁珠分选设各及 剂(CD133 Microbead Kit,human),流式抗体 [CD133/2(293c3-PE]均购自德国Miltenyi公司,兔抗人lxn多克隆抗体(ab13485), 兔抗人bcl-2多克隆抗体(ab18210),鼠 抗人 c-myc单 克隆抗体(ab32)均 购 自英国 Abcam公 司;鼠抗人β -actin单 克隆抗体购自碧云天;Trizol试剂购 自美国Invitrogen公 司;逆转录试剂盒(RevertAidTM First Stland cDNA Synthcsis Kit)购 自美国的 Fermentas(MBI)公 司;荧 光实 时定量 PCR试 剂盒 (SYBR®Premix Ex TaqTM)购 自大连宝生物公司;PCR引 物序列由上海基康生物公司没计合成。

2 CD133+细 胞分选及流式鉴定:人 胰腺癌细胞株 Miapaca-2由本实验室保存并常规培养于含10%胎牛血清的 RPMI-1640培 养基。收集 5× 107个 Miapaca-2细 胞于300ul PBS中重悬,加100u1FCR blocking leagent,100ul CD133- 磁珠,充分混匀,冰上孵育 3O min。 加2ml PBS洗 涤离心后蓖悬于500500ulPBS,加人到事先用500ulPBS润 洗的MS柱 , 待细胞悬液流光后用500ulPBS洗 MS柱 ,重复3次。将MS柱置于15nl离心管中,加1mlPBS并 用活塞将柱中细胞快速压出,所得细胞即为阳性细胞。将分选前细胞与分选得到的阳性细胞与流出的阴性细胞分别重悬于 100ulPBS中 ,加 10ulCD133(293c3)-PE充分混匀,冰上避光孵育 10min. Mouse IgG2b-PE作 为同型对照。加2mlPBS洗 涤离心,重悬于 1.5m1EP管 ,流式细胞仪(BD FACsAria )检测CD133+ 细胞含量。结果用 Flowjo7.6.5软件分析。实验重复 3次。

3 Western blot检 测蛋 白表达:用 RIPA裂 解液提取 CD133+与 CD133-细胞中的总蛋白,BCA法测所得蛋白浓度。以30ug蛋白/泳道上样。常规行蛋白质印迹法检测。兔抗人lxn多抗,兔抗人 bcl-2多抗,鼠抗人 c-myc弟抗,鼠抗人 β -actin单 抗 工 作 浓 度 分 别 为 1∶ 500,1∶500 1∶ 1000,1∶ 1000。 ECL显色,AlphaEaseFC扫 描分析软件系统检测条带灰度值,以 目的蛋白与内参蛋白比值作为蛋白相对表达量。实验重复3次。

4.定 量 RT-PCR检 测 mRNA表达:收集 CDI33 +与 CD133-细 胞,Thol提 取 总 RNA。使 用 逆 转 录 试剂盒 (RevenAidlRI FTMbt stland cDNA Synthesis KTM,fermcIltas)逆转录成 CDNA。使用荧光实时定量 PCR试剂盒 (SYBR® Premk Ex TaqTM (pefect real time), takara) 在 Roche LightCycle480荧 光定量 PCR仪上进行实时PCR检测。lxn引物 序 列 ：上游 5′-GAAGGTCAAACAAGCCAGCA-3′ ,下 游 5'-AACCCAGGCTAAATGTAGAACG-3’。Bcl-2引 物 序 列上 游 5′-CGCAGAGGGGCTACGAGT-3 ,下游 5′-GACGCTCTC- CACACACATJ。 c-myc 引 物序列: 上 游 5′-GGTCTTC- CCCTACCCTCTCA-3’ ,下游5′-CTCCAGCAGAAGGTGATCCA- 3'。β-actin引 物序列 :上 游 5′ -CGTGGACATCCGCAAAGAC- 3′ ,下游 5′ -AAGAAAGGGTGTAACGCAACTAAG-3’。 反应条件 :95 ℃ 30s;95℃ 10s,60℃ 20s,45个循环。实验重复 3次c相对表达量 =2-△ △Ct。

5 统计学处理:使用 SPSS18.0软件进行统计学分析。采用成组t检验。P<0.05为 差异具有统计学意义。

结 果

1CD133+细胞的分选效率:分选前 Mhpaca9细胞中 CD133+细胞 比率为 1.18%± 0.23%,分选后 阳性细胞 中 CD133+细胞比率为94.95%± 0.35%,分选后 CD133-细胞巾 CD133+细胞比率为0.35%±0.12%,阳性细胞与阴性细胞中CD133+细胞比率较分选前细胞差异有统计学意义 (P<0.05)。 2Lxn,l,cl-2,c-myc蛋 白在 CD133+与 CD133-细胞中的表达:CD133+细 胞中lxn,bl-2 ,c-myc蛋 白相对表达量分别为0.35± 0.03,0.27± 0.02和 0.26± 0.02,CD133-细 胞分别为0.89±0.08",0.12±0.01和 0.41± 0.04。 CD133+细胞中 lxn,c~myc蛋 白表达显著低 于 CD133-细 胞 (p< 0.05),而 bc1-2则 显著高于 CD133-细 胞 (P<0.05),见图 3.Lxn,bc12,c-myc mRNA在 CD133+与 CD133-细胞中的表达 :β-actin,lxn,bd9,c-myc mRNA在 CD133+细胞中的Cp值 分 别 为23.3±0.05,28.12± 0.09 ,11.19±0.04, 30.92±0.16;在 CD133-细 胞 中的 Cp值 分别 为23.05± 0.04,26.25± 0.07,11.57± 0.03,29.6± 0 .10。 CD133+与 CD133-细胞相比,lxn与 c-myc mRNA分 别降低了0.325± 0.04倍和0.451±0.05倍;bcl-2增 加 了1.548± 0.15倍 (P<0.05)。

讨 论

Lxn是 哺乳动物中惟一已知的羧肽酶抑制剂,Llang 等[l]发现小鼠造血十细胞数 日与lxn表达水平相反,将lxn 基因转染小鼠使其表达水平升高后,小鼠造血干细胞数日明显减少,说明kn具有调控干细胞生长的作用,并且至少通过两个机制:减少干细胞增殖;促进干细胞凋亡。本研究发现,胰腺癌肿瘤干细胞巾kn表达明显低于普通肿瘤细胞。这些结果提示 lxn在肿瘤的发生及肿瘤干细胞特性的维持中可能具有重要的作用,改变 kn在胰腺癌中的表达可能成为其新的治疗思路。

促凋亡信号通路的异常可促进肿瘤细胞的存活及对化疗的敏感性,而blc-2家族是细胞凋亡的重要调节者,按功能可分为两类,一类具有抑制凋亡作用如 bcl-2等,另一类具有促进凋亡作用如 Bax,Bak等。在很多肿瘤中发现,bcl-2 家族抗凋亡蛋白的过表达与肿瘤的耐药有关[2] ,这预示着以其为靶标的治疗药物能减少肿瘤的耐药,改善肿瘤的治疗效果,我们发现 bcl-2在胰腺癌干细胞中表达明显高于普通胰腺癌细胞.针对 bcl-2的治疗药物有望杀灭肿瘤干细胞,从而改善胰腺癌的治疗结果。

C-myc的失调在很多肿瘤中存在,且常常与肿瘤的预后有关,同时C-myc在十细胞的自我更新及分化屮发挥重要的作用[3].抑制骨髓中 c-myc表达能导致严重的血细胞减少及造血干细胞的积聚,反之,增强 c-myc表达能使造血干细胞发生分化并丧失其 自我更新能力[4]。本研究中,胰腺癌肿瘤干细胞 c-myc的 表达水平明显低于普通胰腺癌细胞。但 Wang等[5]发现 c-myc在 神经胶质瘤肿瘤干细胞中高表达, 且为体外维持所必须。c-myc在肿瘤十细胞特性维持中的确切作用有待进一步研究。综上所述,lxn,c-myc在 胰腺癌肿瘤干细胞中表达低于普通胰腺癌细胞,而 bcl-2则相对高表达,三者在胰腺癌肿瘤干细胞特性的维持中可能具有重要作用。胰腺癌肿瘤干细胞特性的进一步研究有望成为胰腺癌治疗新的方向。

参考文献

[1]Liang Y,Jansen M,Aronow B. The quantitative trait gene latexin influences the size of the hematopoietic stem cell population in mice[J].Nature Genetics,2007.178-188.

[2]Kang MH,Reynolds CP. Bcl-2 inhibitors:targeting mitochondrial apoptotic pathways in cancer therapy[J].Clinical Cancer Research,2009.1126-1132.

[3]Murphy M J,Wilson A,Trumpp A. More than just proliferation:Myc function in stem cells[J].Trends in Cell Biology,2005.128-137.

[4]Wilson A,Murphy MJ,Oskarsson T. c-myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation[J].Genes and Development,2004.2747-2763.

[5]Wang J,Wang H,Li Z. c-myc is required for maintenance of glioma cancer stem cells[J].PloS One,2008.3769.