Smac/DIABLO诱导胰腺癌细胞凋亡并增加对TRAIL及吉西他滨化疗的敏感性

2000年首次从 HeLa细胞中分离出时一种新型线粒体蛋白质被称为第 2个线粒体衍生的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活剂(seccond mitochondria- derived activator of caspase,smac)[1]。 而 Verhagen等 [2]报道从293T细胞中分离出一种蛋白质,称为低等电点凋亡抑制蛋白直接结合蛋白(direct IAP binding protein with low PI, DIABLo)。 经过对 比.分 和 旰 , Smac和 DIABLo完全等同,合称为 Smac/DIABLO. Smac/DIABLO位于线粒体内,凋亡刺激可使其与细胞色素.从线粒体膜间区释放出来,发挥促凋亡作用。多种肿瘤细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导酉 己 体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL) 的凋亡诱导作用具有耐受性,且重复使用会导致某些敏感细胞对其产生获得性抗性。我们采用脂质体转染技术将 pcDNA3.1smac真核表达载体转染到人胰腺癌细胞株 SW1990中 ,应 用不 同浓度 的 TRAIL和(或)吉西他滨作用不同时间,观察外源性 Smac/DIABLO基因过表达对 TRAIL和 (或 )吉西他滨诱导SW1990细胞凋亡的影响,研究 TRAIL所代表的死亡受体凋亡通路及 Smac/DIABLO所代表的线粒体凋亡通路之间的内在联系和可能机制。

材料与方法

一、 材料人胰腺癌细胞株 SW1990、含人 Smac/IlIABLO 全长 基 因 的 真 核 表 达 载 体 pcDNA3.⒈Smac、 lDcDNA3.1空 载体及 DH5α 大肠肝菌均由山东省肿瘤防治研究院和山东省医药卫生肿瘤外科重点实验室提供及保种传代。TRAIL购 自加拿大 Chemicon 公司,Smac/D1ABLO抗体购自CALBIOCHEM公司。

二、方法

转染 SW1990细胞:采用脂质体2000将真核重组表达载体 pcDNA3.1-smac和 pcDNA3.1空 载体转染 sW1990细胞株,获得 2组细胞株:SW1990/ Smac、 Sw1990/neo,培养并绘制生长曲线。

Mm法检测 TRAIL或 吉西他滨对转染前后 SW1990细 胞株 的影 响:分 别 向 SW1990/neo和 SW1990/Smac中 加入不同浓度 TRAIL(200、 500、 1000和2500ng/ml)和 吉西他滨 (10、20、40和 60umoL/L)。 同时 SW1990/neo细 胞 株 中加 人 500 ubc/ml TRAIL和20umol/L吉西他滨为联合组, 每一浓度设 5个复孔,对照组不加药物。培养 12、 24、 48、72h后每孔加 MTT液20ul培养4h,在酶标仪上分别以波长 550nm和630nm测 每孔吸光度 (A值),取 5孔均值。IR=(1-实验组 A自/对照组A值)× 100%,上述试验重复 3次。

流式细胞术检测细胞凋亡率:取对数生长期 SW19⒛ 细胞按 5× 106个/ml接种于25ml培养瓶中,同上分组,联合组及对照组处理同上。培养24h 后收集细胞,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

Heochst 33342染色法观察细胞凋亡:取对数生长期 SW1990细胞按 5× 106个/ ml接种于 12孔培养板,同上分组及处理。培养24h后加入Heochst 33342染液,荧光显微镜下观察凋亡细胞形态。

Western blot检测 smac/DIABL0、ⅪAP、细胞色素 C、 caspase-3、 pS3蛋 白表达:取 对数生长期 SW19⒇ 细胞同上分组及处理,培养24h后提取细胞总蛋白,进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,显色后将硝酸纤维素膜上置人加有 DAB的缓冲液中,数字凝胶成像系统摄像,分别检测 Smac/DIABL0、 ⅪAP、细胞色素 C、 caspASE-3 、 p53蛋 白表达情况.

三、 统计学方法实验结果以勇±s表示,统计学处理应用SPSS 11.5软件,P<0.05认为差异具有统计学意义.

                                                结 果

一 、 稳 定 转 染 Smac/DIABL0基 因 SW199O细胞株的建立及生物学性状

pcDNA3.1-smac质粒转化及酶切鉴定结果: 含有重组质粒pcDNA3. 1-smac的 E.coli DH5α 受体菌在含 AMP的 LB培养基上生长良好。用碱裂解法提取的质粒 DNA,260nm/280nm在 1.8~1.85 之间。采用限制性内切酶 BamH I+Ⅹho I酶 切鉴定,结果证实 Smac/DIABL0片 段长度为7I9bp,质粒片段长度约为5.4lKbp(图 1)。

Smac/DIABLO稳 定表达的细胞株鉴定:经过 4周 G4118筛 选获得 SW199O/Smac,RT-PCR显示筛选出的阳性细胞克隆中,Smac/DIABLO基因细胞的 mRNA及蛋白表达水平均明显高于亲本细胞。

转染 Smac/DIABLO基 因的 SW1990细 胞生物学性状检测:流式细胞仪检测显示:转染空载体的 sW1990细 胞的细胞周期分布:GO~G1:42.65%, G2~M:17.1%,S:40.18%,自 发凋亡率 0.19%。而筛选出的 sW1990/smac细 胞周期分布GO~G1: 50.58%,G2~M:22.57%,S:26.85%,自发凋亡率 0.18%。 转染 Smac/DIABLO的 sW1990细胞的生长 明显 落 后 于转染 空 载体 的 sW1990细 胞 (图 2)。

二、 TRAIL和吉西他滨生长抑制率检测

TRAIL:Smac/DIABLO可增强 SW1990细胞对TRAIL的 敏感性,具有时间及浓度依赖性(P< 0.05),见表 1,2。

吉西他滨:Smac/DIABLD可 增强 sW1990细胞对吉西他滨的敏感性,具有时间及浓度依赖性 (P<0,05)(表 3,4)。

三、TRAIL与吉西 他滨诱 导 SW1990/neo及 SW1990/Smac细胞凋亡检测

TRAIL(500ng/ml)、 吉西他滨 (20umol/L)及 TRAIL(500ng/ml)+吉西他滨 (20umol/L)作 用以 h后 ,细胞呈现典型的凋亡形态。转染空载体的 SW1990细 胞 及 转 染 Smac/DIABLO的 sW199O细胞的凋 亡 率 分别 为 5.64%、 15.30%、27.27 %和 20.37%、23.27%、67.30%(P<0.05)。

四、 TRAIL或 吉 西 他 滨 作 用 于转 染 后 的 sW199O细胞内凋亡相关蛋白表达的变化

SW1990//Neo、 SW1990鸬 mac细 胞 在 TRAIL (500 ng/ml)、吉西他滨(20umol/L)作用24h后 , 均有 Smac/DIABLO、 细胞色素 c及caspase活性裂解片段 p17的表达量升高,ⅪAP蛋白表达量降低; SW1990/Smac细 胞与 SW1990/neo细 胞比较,其检测蛋白的表达量变化幅度更为明显(图 3)。

                                       讨 论

TRAIL作为一种新发现的细胞凋亡诱导分子,可诱导多种肿瘤细胞发生凋亡,而对正常细胞无明显毒性作用。近年来研究证实 Smac/DIABLO在TRAIL诱导细胞凋亡过程中发挥重要作用,而且TRAIL还可与化、放疗协同作用,逆转肿瘤细胞对药物、放射线的耐受性,使其凋亡率明显增加[34]。James等[5]研究发现TRAIL与含CpG的寡脱氧核苷酸联用可诱发针对于原发灶和远处转移灶的系统性的抗肿瘤免疫效应,诱导肿瘤细胞凋亡。TRAIL 诱导的细胞凋亡具有不同的敏感性,有些癌细胞对TRAIL有抗性,使 TRAIL的 凋亡诱导作用明显减弱。应用化疗药物处理肿瘤细胞,能够逆转肿瘤细胞对 TRAIL的抗性。在对卵巢癌和膀胱癌的研究中也证实 TRAIL和化疗药联合应用能够进一步增强 TRAIL的凋亡诱导活性[6-7]。

本研究中将含有 Smac/DIABLO的 真核表达载体 pcDNA3.1-smac质 粒 转 染 人 胰 腺 癌 细 胞 株 SW1990,发 现 Smac/DIABLO高 表达的 SW1990细胞出现 GO/G1期阻滞,S期 比例下降,细胞生长变缓,说明细胞增殖减缓,进而影响肿瘤细胞的生长, 但对细胞的自发性凋亡未见明显影响。转染 Smac/ DIABLO后细胞生长曲线明显落后于转染空载体的细胞,而且细胞凋亡率增高。Smac/DIABLO过 表达可显著增强 SW1990细胞对TRAIL及化疗药物吉西他滨的敏感性,并具有时间及浓度依赖性,细胞呈现典型的凋亡形态。TRAIL及吉西他滨联合应用对诱导肿瘤细胞凋亡具有协同作用。Wcstern blot检测转染后细胞株 中 Smac/DIABLO、 细胞色素 c及 caspase名 活性裂解片段 p17的表达量升高,ⅪAP蛋白表达量降低;其机制可能为 Smac/DIABLO、细胞色素 C从线粒体释放至胞质的量增多,进而使 ⅪAP 表达降低及促进 caspasc名 的激活有关,而与 DR4 表达水平无明显相关。

肿瘤细胞抗凋亡作用在肿瘤发生、 进展和产生耐药等方面具有重要作用,因 而如何诱导肿瘤细胞凋亡和提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性是近年来肿瘤治疗研究中的重点。我们的研究证实 Smac/ DIABLO可 显著增强胰腺癌细胞 SWI990对 TRAIL 和吉西他滨的敏感性,并具有时间及浓度依赖性。在吉西他滨作用于 SW1990/smac细 胞后 Smac/ DIABL0、 细胞色素 C水平显著升高,ⅪAP水平显著降低,并伴有 caspase名 活性成分的升高,表 明吉西他滨可通过线粒体途径诱导细胞凋亡,增强线粒体凋亡中促凋亡因子的表达,增强吉西他滨对肿瘤细胞的杀伤作用。Smac/DIABLO在 TRAIL诱导细胞凋亡发挥重要作用,在与化疗药物联合应用时,不仅可以降低化疗药物的剂量,减少毒副作用,而且有协同作用,明显提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,增强杀伤肿瘤细胞的作用,对肿瘤的治疗有一定的应用前景。

参考文献

[1]DU C,Fang M,Li Y. Smac,a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition[J].Cell,2000.33-42.

[2]Verhagen AM,Ekert PG,Pakusch M. Identification of DIABLO,a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to andantagonizing IAP proteins[J].Cell,2000.43-53.

[3]Abdulghani J,El-Deiry WS. TRAIL receptor signaling and therapeutics[J].EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC TARGETS,2010.1091-1108.

[4]Fandy TE,Shankar S,Srivastava RK. Smac/DIABLO enhances the therapeutic potential of chemotherapeutic drugs and irradiation,and sensitizes TRAIL-resistant breast cancer cells[J].Molecular Cancer Therapeutics,2008.60.

[5]James BR,Griffith TS. Oncoimmunology.Activation of systemic antitumor immunity via TRAIL-induced apoptosis[J].Oncoimmunology,2012.1178-1180.

[6]Khaider NG,Lane D,Matte I. Targeted ovarian cancer treatment:the TRAILs of resistance[J].Am J Cancer Res,2012.75-92.

[7]Szliszka E,Mazur B,Zydowicz G. TRAIL-induced apoptosis and expression of death receptor TRAIL-R1 and TRAIL-R2 in bladdercancer cells[J].Folia Histochemica et Cytobiologica,2009.579-585.