Celecoxib通过抑制Survivin表达促进肺癌A549细胞凋亡

作者:龙伟,周锐

作者单位：1.湖南省吉首大学医学院临床医学系，湖南 吉首 416000；2.中南大学湘雅二医院，湖南 长沙410011        【摘要】  　　［目的］研究 Celecoxib对肺癌A549细胞生长和凋亡的影响并探讨其作用机制。［方法］用Western blot法检测Celecoxib抑制肺癌A549细胞后生存素（Survivin）表达的变化；用酶联免疫吸附法（ELISA）测定培养上清液中前列腺素2（prostaglandin-2，PGE2）含量的变化；用四唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖；流式细胞仪测定细胞周期。［结果］ 随着Celecoxib剂量的增加和时间的延长，PGE2的含量减少，survivin表达也相应减少，细胞增殖减少而凋亡增加。［结论］Celecoxib可以通过PGE2的途径下调A549细胞survivin的表达并促进细胞凋亡。

   【关键词】  A549细胞　Celecoxib　前列腺素2　环氧合酶2　生存素

　　Celecoxib Promote Apoptosis in Human Lung Cancer A549 Cells by Inhibiting Survivin

    LONG Wei1, ZHOU Rui2

    (1.Medicine Institute of Jishou University, Jishou 416000, China;

    2.Xiangya Second Hopital of Central South University, Changsha 410011, China)

    Abstract： ［Purpose］ To investigate the effect and mechanism of Celecoxib in inducing proliferation inhibition and apoptosis in human lung cancer A549 cells.［Methods］ The expression of survivin through Celecoxib blockading were detected by Western Blot. ELISA were used to detect the change of prostaglandin-2 (PGE2) content in the supernatant of culture solution. The anti-proliferative effect was measured by using Methabenzthiazuron (MTT) assay. Cell cycle and apoptosis were analyzed by using flow cytometry. ［Results］ With the blockade of Celecoxib increased, the PGE2 content reduced and the expression of survivin weakened, but the apoptosis rised. ［Conclusion］ Celecoxib can down-regulate the expression of survivin and then promote the apoptosis of A549 cells via PGE2 pathway.

    Key words: A549 cell; Celecoxib; PGE2; COX-2; survivin

    Celecoxib是COX-2的特异性抑制剂，最初用于治疗类风湿性关节炎和骨关节炎，近十几年来发现其具有抗肿瘤作用，作用机制可能与抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，且抑制肿瘤血管生成并对周围组织的粘附侵袭有关。Survivin是近年来发现的抗凋亡蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的新成员，在人类绝大多数恶性肿瘤中均有表达，通过对抗细胞凋亡而有利于肿瘤的生长。目前，有关Celecoxib与survivin的关系报道极少。我们研究的目的是要观察Celecoxib对肺癌A549细胞survivin表达的影响，探讨Celecoxib调节survivin表达进而促进A549细胞凋亡的分子机制。

    1 材料与方法

    1.1 材 料

    人肺癌A549细胞来自于中南大学湘雅医学院肿瘤研究所；DMEM培养液和胎牛血清购自美国Hyclone公司；survivin一抗及二抗购自北京中杉公司（美国Santa Cruz公司产品，进口分装）；Celecoxib购自辉瑞公司；PGE2购自Sigma公司；酶联免疫检测试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司；紫外分光光度计购自美国BACKMEN公司；酶联免疫检测仪购自芬兰Labsystems Dragon公司。

    1.2 方 法

    1.2.1 细胞培养及提取蛋白

    A549细胞接种在含10ml DMEM（含10%小牛血清，青霉素和链霉素各100U/ml，下同）的直径10cm的培养皿中，置于37℃、5%CO2无菌培养箱中培养，2~3d换液，0.25%的胰酶消化传代。为避免血清对实验的影响，待细胞长到70%~80%成熟时换无血清DMEM培养液行 Celecoxib干预。干预分为Celecoxib量—效关系组和时—效关系组，每组4皿。Celecoxib量—效关系组每皿分别给予Celecoxib 0、10、20、40μmol/L，12h后裂解细胞提取蛋白；Celecoxib时—效关系组每皿分别给予20μmol/L的Celecoxib，分别在0、6、12、24h裂解细胞提取蛋白。每皿在裂解细胞前先留取适量培养上清液，用于做ELISA检测PGE2含量。

    1.2.2 ELISA检测培养上清液中PGE2

    收集Celecoxib干预各个不同浓度点和时间点的细胞培养上清液，取0.5ml上清液加入1N HCl 0.1ml，离心10min，收集上清液再加入1.2N NaOH 0.1ml以中和酸性化了的样品。把100μl的标准品或样品分别加入相应孔中，余下操作步骤按PGE2 ELISA试剂盒要求进行。在酶联免疫检测分析仪上测定OD492nm值，不加样品的孔作为空白对照孔用于调零，每一个标准品和样品均设置复孔，实验重复3次。

    1.2.3 Western blot测量survivin表达

    提取蛋白后4℃低温超速（13 000r/min）离心，留取上清液，用考马斯亮蓝G250法测定每个样品的总蛋白含量。分离胶浓度为12%，积层胶浓度为5%；每个加样孔的蛋白上样量为100μg。电泳时，积层胶为80V 30min，分离胶为120V 60min。电泳后制“三明治”行湿性转膜12h。5%PBS脱脂奶粉封闭液封闭3h，PBS液清洗3次，每次15min；一抗孵育2h（survivin一抗按1：200稀释），清洗3次，每次15min；二抗反应50min（二抗按1：3 500稀释），清洗3次，每次15min，ECL显影。

    1.2.4 MTT检测细胞凋亡情况

    为了确定Celecoxib是否通过PGE2途径影响细胞的凋亡，96孔培养板中除设置Celecoxib量—效关系组和时—效关系组外，还相应设置了Celecoxib+PGE2量—效和时—效关系组。每个浓度点和时间点均种4孔并设置对照，计算其OD值均值。每孔接种细胞8 000个，加入10%DMEM使总体积为200μl，培养24h细胞贴壁后进行干预。Celecoxib量—效关系组设0、10、20、40μmol/L四个浓度点，分别用A1B1C1D1表示；Celecoxib+PGE2量—效关系组设Celecoxib 0、10、20、40μmol/L及PGE2 100pg/ml四个浓度点，分别用A2B2C2D2 表示；干预12h后每孔加入MTT液20μl(5mg/ml),震荡器震匀，继续培养4h后液体倒出拍干，每孔给予DMSO 150μl 震匀10min，送酶联免疫检测分析仪中计算其OD490nm值。Celecoxib时—效关系组设6、12、24h3个时间点，用B3C3D3表示，分别每孔分别给予Celecoxib 20μmol/L； Celecoxib+PGE2时-效关系组设6、12、24h3个时间点，用B4C4D4表示，每孔分别给予Celecoxib 20μmol/L及PGE2 100pg/ml；无干预对照时—效关系组用B5C5D5表示；操作方法与量—效关系组相同，分别在干预6、12、24h后处理细胞进行实验。

 1.2.5 流式细胞检测细胞周期及凋亡

    收集不同浓度Celecoxib（0、20、40μmol/L）处理12h后的A549细胞，0.25%胰酶消化及PBS冲洗液，1 000r/min离心10min，-20℃预冷的80%乙醇固定，送北京鼎国生物实验室作细胞周期及细胞凋亡分析，实验重复3次。

    1.3 统计学处理

    计量资料均以x±s表示，采用SPSS11.0统计软件包的t检验，P<0.05为有显著性意义。

    2 结 果

    2.1 ELISA结果

    Celecoxib对PGE2释放水平的影响：Celecoxib能够抑制PGE2的释放，这种抑制具有时间效应和剂量效应：20μmol/L的Celecoxib处理6、12、24h PGE2水平分别为（38.9±4.62）pg/ml，（22.23±3.89）pg/ml， （11.08±3.61）pg/ml，与对照组（0h）（47.62±5.51）pg/ml相比较，其差异有统计学意义（P值分别＜0.05，0.01，0.01）；10、20、40μmol/L的Celecoxib处理PGE2水平分别为（35.23±4.12）pg/ml，（21.01±3.17）pg/ml，（6.92±2.35）pg/ml，与对照组（0μmol/L）（46.27±4.88）pg/ml相比较，其差异也有统计学意义( P值分别＜0.05，0.01，0.01)。

    2.2 Western blot结果

    如图1A、B，可见随着Celecoxib作用时间的延长和剂量的增加，survivin表达的条带逐渐减弱（图1C为β-actine参照），说明Celecoxib能够抑制survivin表达。

    2.3 MTT结果（OD值）

    MTT实验结果显示，随着Celecoxib剂量的增加其OD值如图2A：A1B1C1D1分别为0.4124，0.2967， 0.1014，0.0025；A2B2C2D2分别为0.5578，0.3997，0.2834，0.0956，差异有显著性（P＜0.01），说明细胞凋亡显著增加，并且PGE2对其有明显的对抗作用；随着时间的延长，也出现细胞增殖减少而凋亡明显增加，OD值如图2B：B3C3D3分别为 0.1572，0.1108，0.0419；B4C4D4分别为 0.3194，0.2996，0.2838；B5C5D5分别为 0.3846，0.4457，0.7652，差异具有显著性（P＜0.01），PGE2也显示了明显对抗Celecoxib的作用。说明Celecoxib能够诱导细胞凋亡并且是通过抑制PGE2的释放实现。

    2.4 流式细胞检测结果

    流式检测结果如图3所示，Celecoxib 20μmol/L时G1/G0为67.82，而40μmol/L时G1/G0为75.52，两者比较差异有显著性（P＜0.01）；两者与对照组（G1/G0 56.6）比较，差异有显著性（P＜0.01），说明Celecoxib能够使细胞增殖阻滞于G1/G0期。

    3 讨 论

    Survivin基因是IAP家族的一个新成员，在各种人类恶性肿瘤细胞中均有不同程度的表达。Survivin主要在细胞周期G2/M期表达,Survivin与活化的Caspase-3和Caspase-7结合，抑制凋亡通路下游的汇集点Caspase-3和Caspase-7,使Caspase超分子聚合体分离，从而抑制其活性，保护了关键的细胞周期调节因子如p21wafl，从而抑制了细胞凋亡[1]。研究发现[2]survivin可以和周期素依赖蛋白激酶(CdK4)结合，形成survivin / CdK4复合体，使CdK2/Cyclin E激活、Rb磷酸化，导致p21蛋白从CdK4解离。p21蛋白通过结合于G1期和S期的周期素依赖蛋白激酶(cyclin D1-CdK4和cyclin E-CdK2)抑制其活性，使细胞增殖停留在G1期。Survivin使p21解离导致CdK4活化，细胞进入增殖周期，导致大量细胞无限制生长，有利于肿瘤的发生。

    与其他恶性肿瘤一样，肺癌的发生除了与致癌物质直接导致细胞恶性转化有关外，与慢性炎症的长期刺激也有一定的关系（在大多数人类的恶性肿瘤中，都发现了COX-2的高表达）。作为COX-2的选择性抑制剂，Celecoxib近年来被发现具有抗肿瘤作用。目前,Celecoxib的作用机制还不是很清楚，可能有以下几种途径：①抑制PGE2的分泌，Sun等[3]发现，Celecoxib对COX-2高表达的A549细胞有明显的抑制作用，并能使其分泌的PGE2减少，而对COX-2低表达者无明显抑制。②激活外源性凋亡途径以及凋亡汇集因子Caspase3和7Gargi 等[4]研究发现Celecoxib能激活Caspase3和7并使细胞周期停滞在G0/G1期；Liu等[5]发现，Celecoxib可以抑制肿瘤细胞存活，激活Caspase8并进而激活Caspase级联反应，从而启动外源性凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡。

    尽管研究表明Celecoxib能够激活细胞凋亡途径及凋亡汇集因子Caspase3和7，但是其具体的路径还不是很清楚。我们的实验表明，Celecoxib能显著抑制肺癌A549细胞释放PGE2，明显下调survivin的表达，其程度与PGE2释放被抑制的程度呈正相关，而且这种下调具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。流式细胞检测结果表明，通过下调survivin的表达，A549细胞的增殖停留在G1/G0期；MTT实验结果表明，Celecoxib能显著促进A549细胞凋亡。说明Celecoxib能抑制PGE2释放并下调survivin的表达是其抑制肿瘤细胞的途径之一。

【参考文献】[1] Shin S,Sung BJ, Cho YS, et al. An Aneli-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of Caspase3 and -7[J]. Biochemistry, 2001,40(4): 1117-1123.

[2] Suzuki A,Ito T, Kawano H, et al. Survivin initintes procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death [J]. Oncogent, 2000,19(10): 1346-1353.

[3] Shi-Yong Sun, Claudia P, Schroeder, et al.Enhanced growth inhibition and apoptosis induction in NSCLC cell by combination of Celecoxib and 4HRR at clinically relevant concentrations[J]. Cancer Biology and Therapy,2005,4(4):407-413.

[4] Gargi DB,Latha BP, Teresa LT, et al.Mechanisms underlying the growth inhibition effects of the cycle-oxygease-2 inhibitor celecoxib in human breast cancer cells[J]. Breast Cancer Res,2005,7(4):422-435.

[5] Xiangguo Liu,Ping Yue,Zhongmei Zhou, et al. Death receptor regulation and Celecoxib-induced apoptosis in human lung cancer cells [J]. Journal of the National Cancer Institute, 2004,96(23):1796-1780.