胃癌患者血浆p53、K-ras基因突变及临床意义
发表时间：2009-06-24 浏览次数：705次
作者:陈积贤,张洁,豆长明
作者单位：1.温州医学院第三附属医院，浙江 瑞安 325200；2.温州医学院生物实验中心，浙江 温州 325003 【摘要】 ［目的］ 研究胃癌患者血浆中基因表达检测的可行性，探讨基因p53 和K-ras突变与临床病理间的关系。［方法］ 应用PCR-SSCP分析技术，检测62例胃癌患者血浆中K-ras癌基因的突变情况。［结果］ 62例胃癌患者外周血和门静脉血中的p53、K-ras突变阳性率分别为8.06%、4.83%和38.71%、33.87%；无、有肝转移患者p53、K-ras突变阳性率分别为24.49%、22.45%和92.30%、76.92%；门静脉血p53、K-ras突变阳性率分别为38.71%、33.87%和56.45%、62.90%。［结论］ 胃癌的发生发展与血浆中癌基因K-ras与抑癌基因p53的突变有关。
【关键词】 胃肿瘤 单链核酸构像多态性 基因 p53 基因 K-ras
我国胃癌发病率高达5/10万~40/10万[1]。胃癌的发生、发展是一个多因素、多基因控制的复杂过程。目前已知几十种基因与胃癌发病有关，p53和K-ras基因突变与胃癌的发生和发展均有密切关系，是胃癌诊断指标中的关键基因。本研究运用SSCP技术，寻找胃癌患者血浆中p53 和K-ras 基因突变和胃癌临床病理的对应关系。
1 材料与方法
1.1 标 本
胃癌患者62例，其中男性53例，女性9例，平均年龄63岁，经病理组织学证实并行手术治疗。其中胃癌部位：A区31例，M区16例，C区2例，MC区6例，MA区4例，MCA区3例。病理分化程度：高分化腺癌11例，中分化腺癌21例，黏液腺癌8例，低分化腺癌22例。分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期7例，Ⅲ期30例，Ⅳ期20例。有淋巴结转移42例，无淋巴结转移20例。采集剖腹前外周静脉血、剖腹后胃癌探查前和探查后胃癌切除前门静脉血各5ml,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝, -20℃冻存。
1.2 DNA提取（chelex-100方法）
首先取1ml红细胞裂解液，加150μl全血（冰冻过夜），混匀，室温放置10min；10 000r/min转离心3min，弃上清，加PBS (pH7.4)1ml洗2次；沉淀加200μl chelex-100，充分混匀；沸水浴10min，立即冰上冷却；12 000r/min离心 3nin，取上清备用（-20℃保存）。
1.3 PCR 扩增
反应体系：15mM氯化镁5μl、10×扩增缓冲的dNTP 5μl、引物各25pmol、基因组DNA 1μl、去离子水适量配制50μl进行扩增；反应条件：96℃预变性7min，94℃下加入TaqDNA 聚合酶5U，94℃40s 变性、55℃ 1min退火, 72℃ 1min延伸、循环35 次，72℃充分延伸7min。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，紫外光下鉴定产物质量。所用引物序列见表1。
1.4 SSCP
调整PCR 产物浓度，使各标本浓度相当，取8μl产物加入等量甲酰胺，热变性后，立即置冰浴，加入0.25%溴酚蓝加样缓冲液，置6%聚丙烯酰胺凝胶(29：1)中电泳，4℃，电压200V，约5h ，银染观察结果。
1.5 统计学处理
对实验数据进行χ2检验。
2 结 果
2.1 PCR扩增p53、K-ras基因
所有样本基因组DNA经PCR扩增后均可见到特异性片段。琼脂糖凝胶电泳（图1）显示其满足PCR-SSCP 所要求的模板DNA质量，即产物纯度较高且长度较短。
2.2 p53、K-ras基因突变
变性丙烯酰胺凝胶电泳条带差异表示有突变产生（图2）。62例胃癌患者门静脉血中，24例(38.71%)在p53基因3个片段上产生点突变，21例(33.87%)在K-ras基因3个片段上产生点突变。两者总突变率为53.23%，其中12例为双重突变 。
突变的位点在p53和K-ras 基因各外显子上分布也存在差异。表2显示：p53基因区域中，外显子7、8区间突变比例较高，而外显子8突变比例较低；K-ras 基因中，外显子1突变最为集中，是突变的热点。
2.3 p53、K-ras 基因突变与相关因素的关系
62例胃癌患者中部分p53、K-ras基因产生突变，具体数值见表3。统计结果提示，外周静脉血和门静脉血有无肝转移，手术操作的前后检测的p53，K-ras 基因突变差异有显著性(P＜0.05)。另外，结合临床资料发现，p53，K-ras 基因突变在患者的年龄、性别及病理分化程度等因素中未见统计学意义。
3 讨 论
癌变过程是多基因、多步骤相互作用的过程。原癌基因激活、抑癌基因失活及编码产物的过度表达均在肿瘤细胞的恶性转化和增殖失调中扮演重要角色。其中p53基因的丢失和突变，ras基因的突变[2，3] 可导致细胞大量增殖和恶性转化。本研究显示了胃癌外周静脉p53、K-ras基因突变阳性率仅分别为8.06%、4.83%，而门静脉血中p53、K-ras则分别为38.71%、33.87%，门静脉血中突变率明显高于外周静脉血（P<0.05）。推测这是由于门静脉回流经过胃部，可携带恶性转化的癌细胞。肝转移组p53、K-ras基因突变阳性率为92.30%、76.92%；无肝转移组仅为24.49%、22.45%，肝转移组高于无肝转移组。这是因为手术操作使癌细胞脱落经门静脉至肝内播散[4，５]，本研究从p53、ras基因突变的水平上确证了这个观点，同时也提示在手术操作时应避免对肿瘤的挤压, 防止门静脉血回流导致肝内微转移，尽最大可能减少癌细胞的远处播散[６]，防止肿瘤恶化。
研究还显示p53突变主要集中在第5~7 外显子，而ras 突变主要集中第1外显子上，说明p53第5~7 外显子及K-ras第1外显子位点可能是胃癌中p53、ras 基因突变的热点。
基因检测为胃癌的诊断开辟了一条新的途径。常规的基因检测材料是病人的肿瘤组织或肿瘤周围组织，但是要取得材料需要手术，因此不能作为常规的诊断材料。Anderson 等[7]曾利用Southern blot方法在大肠癌患者的粪便中检测到突变的ras基因。王新美等[8]通过检测胃癌患者胃液中p53、ras基因突变。材料的改变使胃癌的诊断带来的新的希望，但是以粪便或胃液为材料存在着不易保存和对胃癌转移的敏感性不高的缺点。本研究利用血浆作为实验材料，能够携带足够的遗传信息，而且相对于其它实验材料又容易获取和保存，是理想的实验材料。研究结果显示，门静脉血p53、ras基因两种基因总阳性突变率达53.23%，其中晚期肝转移p53、K-ras阳性率分别高达92.30%、76.92%。结果提示血浆中p53、K-ras基因突变分析是预测胃癌肝转移较理想的依据，并具有易实施的特点，因此在临床上有一定价值。
【参考文献】 [1] 徐珊, 单祥年.用PCR-SSCP 及DNA 测序法研究胃癌p53 基因突变[J].第四军医大学学报，2001,22 (14)：103-133.
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[8] 王新美, 齐兆生, 李建钊. 胃癌及胃液中p53、ras 基因突变与临床病理的关系[J].临床与实验病理学杂志，2002, 12（8）：177-180.
