表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗肿瘤研究进展

作者:陈志鸿,罗招阳

 作者单位：1.湖南省人民医院，湖南 长沙 410005；2.南华大学病理学教研室，湖南 衡阳 421001          【摘要】  　　表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶中主要活性成分之一，具有抑制肿瘤细胞增殖的活性。文章从EGCG在生物体内的分布及其代谢特点，诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞以及调控癌基因、抑癌基因表达等分子机制方面综述近年来国内外对EGCG抗肿瘤研究的新进展。

   【关键词】  表没食子儿茶素没食子酸酯　肿瘤　分子机制　进展

　　茶是一种由山茶科植物叶片制成的饮料，每年生产和消费的茶叶超过30亿千克，其中78％为红茶，20％为绿茶，2％为乌龙茶[1]。它们是由不同的生产流程制造的。其中，绿茶在亚洲地区深受人们青睐。近年来，国内外众多研究者对绿茶中的提取物进行了大量的研究，流行病学调查[2~4]，动物试验[5,6]，细胞培养[7~10]等研究均提示绿茶对人体大多数肿瘤的发生、发展具有抑制作用。绿茶干重的30％~42％是儿茶素（catechins）包括表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），表没食子儿茶素(EGC)，表儿茶素没食子酸酯（ECG），表儿茶素（EC）[11]。其中，表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）的抗癌作用尤为显著。本文围绕EGCG抗肿瘤机制的研究进展作一综述。

    1 EGCG在体内的分布及生物利用度

    Masami Suganuma等利用放射标记的（[3H]EGCG）对CD-1鼠进行研究，证实EGCG可在鼠体内广泛分布[12]。利用[3H ]EGCG直接灌胃，在鼠的消化道、不同的器官、血液、粪及尿液中均检测到了放射线的存在。他们证实如同先前报道的EGCG的靶器官(消化道、肝、肺、前列腺、乳腺、皮肤)一样，EGCG同样存在于脑、肾、子宫、卵巢及睾丸中。同时发现6h后再次给予相同剂量的EGCG可以显著提高EGCG在体内的浓度，是只给一次的4~6倍。另有研究者对老鼠按体重500mg/kg给予口服EGCG，60min后利用化学发光—高效液相色谱法(CL-HPLC)检测，EGCG在血浆中浓度为12.3nmol/ml，肝脏中为48.4nmol/g，脑中为0.5nmol/g，小肠黏膜565nmol/g，结肠黏膜68.6nmol/g。组织中EGCG的含量约为摄入量的0.0003%~0.45％[13]。U Ullmann 等对60例健康志愿者进行了EGCG的耐受性、血药浓度及安全性研究[14]。他们设计了一个随机、双盲、安慰剂对照的实验。每组10人，其中两人给予安慰剂，另8人分别给予50mg、100mg、200mg、400mg、800mg、1600mg纯度为94％的EGCG。研究表明：一次口服EGCG1600mg对人体不会造成伤害，可以耐受。服用EGCG后，在人体内血药浓度随时间有一个快速吸收峰，随后是降低和消散期。总EGCG的平均AUC（area under the concentration-time curve from 0h to infinity）从442ng/（h·ml）到10 368ng/（h·ml）；Cmax(the maximam plasma concentration)值从130ng/ml到3 392ng/ml，1.3h到2.2h达到血浆最大浓度值Cmax；半衰期t1/2在1.9h到4.6h之间。对健康个体进行长期口服大量EGCG的试验研究，受试者每日口服EGCG800mg一次，或分两次口服，同时设立安慰剂对照组，4周后观察其不适反应，检测血样。4周后，受试者所述不适(胃部不适、恶心、腹痛、头痛等)与安慰剂对照组差异无显著性。研究还发现，800mg组血浆AUC值增加了60％。表明健康个体每日饮用绿茶8~16杯（其中EGCG含量约为800mg）是安全的，且大量饮茶能显著提高EGCG在人体血浆中的浓度。众多研究均证实，EGCG能被人体吸收，并且在体内大多数器官中存在，加大剂量能显著提高其在体内的浓度。

    2 EGCG抗肿瘤的机制

    2.1 诱导肿瘤细胞凋亡

    细胞凋亡是在特定时空中发生的受机体严格调控的程序化细胞死亡过程。细胞凋亡最早由Kerr，Wyllie和Currie等正式提出，认为是一种正常的生物学老化现象[15]。随后的研究发现细胞凋亡不但与细胞生命正常代谢有关，而且与细胞发育、肿瘤形成和治疗也密切相关。诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的重要策略之一。目前大多数化疗药物都是通过诱导细胞凋亡达到清除肿瘤细胞的作用。FAS是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族中的一员。Fas-Fas配体系统是凋亡过程中的主要途径之一[16]。研究表明EGCG能与Fas结合，启动Fas介导的凋亡过程，活化Caspase8,从而诱导人单核细胞白血病U937凋亡[17]。对于前列腺癌LNCaP细胞的研究显示：EGCG通过使p53蛋白的稳定性增强并且上调p53表达，从而使其下游蛋白p21WAF1和Bax活性增强，使Bax/Bcl-2朝有利于肿瘤细胞凋亡的比例改变[18]。Bcl-2家族成员的变化触发Caspases家族成员的瀑布式反应，最终导致细胞发生凋亡。细胞凋亡是基因控制下的细胞自我消亡的过程。EGCG诱导细胞凋亡是否存在选择性，诱导凋亡作用是否存在确切途径，迄今仍有待继续研究。

    2.2 诱导肿瘤细胞周期阻滞

    细胞的分裂、生长、死亡都存在一套精密的调控系统，细胞周期调控机制。细胞调控机制的紊乱，细胞失控性增长，其结果导致肿瘤的发生。因此研究肿瘤细胞的周期调控，寻找诱导肿瘤细胞周期阻滞的药物，有望为肿瘤的防治提供新途径。细胞周期的正常运行需要两大机制的调控：细胞周期的启动机制和监控机制。G1期检测点是决定细胞是否通过G1期进入S期的重要调控点。其中CyclinD-Cdk4/6与CyclinE/Cdk2是G1期进行的限速步骤。CyclinD或CyclinE的过度表达均能缩短G1期时间或加速G1期进行。视网膜母细胞瘤蛋白Rb处于低磷酸化状态时能扣留大量的转录因子（E2F等），从而抑制许多S期必需基因产物的表达（如CyclinA、CyclinE等），而在Rb高磷酸化状态时可释放转录因子，从而产生细胞周期运行所需的蛋白质，驱动细胞周期进行[19]。研究报道EGCG能诱导肿瘤细胞周期发生阻滞。对人乳腺癌MCF-7，EGCG可诱导其G1期阻滞。在这一过程中，CyclinD与CyclinE的表达下调而Rb由低磷酸化状态转为高磷酸化状态，同时使Cdk2和Cdk4呈剂量依赖关系性抑制。能抑制Cdk的p21蛋白及与此相关的p53蛋白表达的上调[20]。相似的周期阻滞作用也可发生在人结肠癌LoVo细胞[7]，人表皮癌A431细胞[8]，人前列腺癌LNCaP、DU145细胞[9]，以及人宫颈癌CaSki细胞[10]。

    2.3 对细胞信号传导通路的影响

 信号传导是细胞外因子通过受体（膜受体或核受体）结合，引发细胞内一系列的生物化学反应直至细胞生理所需基因的转录表达开始的过程。信号传导的经典途径为细胞外因子、受体、连接蛋白、G蛋白、第二受体、胞内激酶、核受体。在肿瘤细胞中由于基因调控紊乱，可以导致细胞信号传导网络的异常，使细胞处于失控性生长状态。细胞内最重要的激酶链系统是丝裂原活化蛋白激酶通路(mitogen-activated protein kinase pathway，MAPK pathway)，其中研究得最充分的是Erk，JNK/SAPK和p38三条通路。Jee Y.Chung对转染了突变H-ras基因的鼠表皮细胞JB6细胞株研究发现，EGCG能抑制Raf-1与MEK1的结合，下调Erk1/2与MEK1/2蛋白的磷酸化，从而抑制Ras-MAPK信号通路的传导[21]。Choi YJ研究发现在EGCG与钒酸盐共同作用诱导U937细胞发生的凋亡中，Erk信号通路扮演着重要角色[22]。Saeki K对人白血病U937和OCI-AML1a细胞研究发现EGCG可作用于JNK和p38信号传导通路，通过活化caspase-3、caspase-9以及MKK3/6、MKK4、ASK1、JNK1等诱导肿瘤细胞凋亡[23]。对人表皮癌细胞A431研究显示，EGCG能抑制酪氨酸蛋白激酶（PTK）对EGF-R,PDGF-R和FGF-R的作用，从而阻断细胞外生长因子与其相应受体的结合，从而阻断其生长信息的传递。

    2.4 抑制肿瘤细胞侵袭和转移

    肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞脱离原发肿瘤，通过各种方式转移到其他组织或器官继续生长，形成与原发肿瘤相同性质的继发性肿瘤的过程。肿瘤转移是恶性肿瘤的基本特征，是临床肿瘤患者主要致死原因。肿瘤新生血管的形成是肿瘤侵袭、转移的必要条件。血管内皮生长因子（VEGF）具有较强的刺激血管形成的作用。Jung YD发现EGCG能抑制人结肠癌HT-29细胞中VEGF的表达。对接种了瘤细胞的BALB/C裸鼠腹腔内注射EGCG，与对照组相比微血管密度降低30%,据此认为EGCG能通过抑制血管形成发挥抗癌效应[24]。EGCG能通过多种途径抑制肿瘤新生血管的形成。EGCG能够通过增强血管平滑肌中p53的稳定性以及NFкB复合物形成的途径引起增殖的血管平滑肌细胞凋亡。细胞外基质和基底膜的降解和破坏是肿瘤转移多阶段过程中的重要步骤。在人纤维肉瘤HT-1080细胞中，EGCG能抑制膜类基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）活性从而导致基质金属蛋白酶-2在细胞表面积聚[25]。这可能是EGCG抑制肿瘤细胞侵袭的作用机制。有研究表明EGCG能抑制VEGF与其受体结合，从而抑制肿瘤形成新生毛细血管，达到抑制肿瘤细胞侵袭的作用[26]。慢性淋巴细胞白血病B细胞(CLL B cells)能表达VEGF膜受体，并且合成和释放VEGF。Lee YK 用EGCG处理CLL B细胞后发现VEGF受体(VEGF-R1、VEGF-R2)磷酸化受到抑制，从而阻断CLL B细胞通过自分泌途径刺激增殖，从而导致肿瘤细胞死亡[27]。

    2.5 其他作用机制

    2.5.1 抗氧化作用

    人类重大疾病（肿瘤、心血管）和衰老均与体内自由基生成过多有密切的关系。自由基是一类寿命很短，但是性质非常活跃且具有单个不成对电子的化学基团。自由基的大量出现是致癌机制之一。它可以凭借其亲电子本性与一些大分子化合物相结合，成为潜在的致癌因素。因此对自由基的清除效应是抗癌、抗突变的重要机制之一。在正常生理条件下，生物体内自由基不断产生，也不断被清除。处于平衡状态的自由基浓度是很低的。但在某些情况下，自由基的产生和清除失去平衡，往往是自由基的浓度增高到损伤机体的程度。自由基的形成大多是内源性的。吸烟、空气污染、紫外线辐射以及人体免疫功能低下均会诱导自由基的形成。茶叶中富含的多酚类化合物具有很活跃的羟基氢，能提供活跃的氢与自由基反应，生成惰性产物或较稳定的自由基，因而中断或减慢自由基参与的反应。陈留记等采用电子自旋共振技术和化学发光法，利用体外黄嘌呤（X）/黄嘌呤氧化酶（XO）、Fenton反应及促癌剂PMA刺激人多形核白细胞（PMN）呼吸爆发产生活性氧自由基模型。研究表明，茶多酚及其单体对氧自由基的清除率可达98％，在一定浓度范围内呈量效关系，且均优于传统的抗氧化剂维生素C、维生素E等[28]。研究表明，绿茶及其提取物均具有较强的清除氧自由基活性，而EGCG是其提取物中抗自由基活性最强的成分[29，30]。这可能是EGCG抗肿瘤的重要机制之一。

    2.5.2 抑制端粒酶活性

    端粒(telomere)是真核细胞线形染色体末端由端粒DNA和端粒蛋白质构成的一种特殊结构。在正常情况下，随着细胞分裂，端粒进行性缩短并诱发一系列分子事件，最终导致细胞凋亡。端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶，主要成分是RNA和蛋白质。近年来人们在较多永生化细胞株及大多数肿瘤组织中检测到活化状态的端粒酶，而绝大多数正常组织中端粒酶为阴性。因此认为端粒酶的激活与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。Mittal A研究人乳腺癌MCF-7细胞发现，EGCG能通过抑制人端粒酶催化亚单位hTERT(human telomerase reverse transcriptase)而抑制乳腺癌细胞中端粒酶的表达[31]。

    3 问题与展望

    茶作为一种古老的饮料至今仍广为流传。随着现代研究的深入，绿茶及其提取物的实验研究揭示了它众多的功效，如抗氧化、清除氧自由基、预防肿瘤的发生、发展、抑制肿瘤细胞增殖。肿瘤的形成是一个多步骤、多因素、多阶段的过程。正常细胞恶化为肿瘤细胞涉及到多个癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体、DNA修复基因等异常的积累。细胞的分裂、增殖、死亡均处于一个复杂的网络控制之中，这一网络中某些蛋白表达异常，均可能导致细胞增殖失控，发展成为肿瘤细胞。众多研究显示ECCG有可能从诱导凋亡、周期阻滞、信号传导、抑制肿瘤侵袭等众多方面做了阐述。因此对EGCG能抑制肿瘤细胞的增殖作用是较为肯定的。然而在众多的分子机制中，EGCG作用于肿瘤细胞是否存在特异性的靶蛋白，是否存在特异性的分子通路能够解释其对各种肿瘤细胞的抑制效应，尚有待于研究者继续努力。

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