siRNA介导的survivin基因沉默诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡的研究

作者:曹正国,诸禹平,周四维作者单位：1.安徽省立医院，安徽 合肥 230001；2. 华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030          【摘要】  　　［目的］ 研究siRNA（small interference RNA）对人膀胱癌BIU-87细胞凋亡和survivin基因表达的影响。［方法］ 利用Ambion公司设计软件，设计并体外转录合成针对survivin基因的3个特异性siRNA，通过脂质体将siRNA转入BIU-87细胞，分别采用MTT和DNA原位末端标记（TUNEL）法检测siRNA对BIU-87细胞生长抑制率（IR）和凋亡指数（AI），半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blotting检测siRNA对survivin mRNA及其蛋白表达的影响。［结果］转染后的siRNA1～3组的BIU-87细胞的IR（41.84%、56.21%、54.13%）和AI（21.98%、36.54%、31.34%）均分别显著高于正常对照组（1.98%和3.17%）（P＜0.05），survivin mRNA及其蛋白表达水平均显著低于对照组；其中siRNA2～3对BIU-87细胞的IR、AI和survivin表达的抑制作用均显著高于siRNA1。［结论］体外转录合成的siRNA可抑制BIU-87细胞survivin的表达，诱导BIU-87细胞凋亡，从而抑制BIU-87细胞生长，为siRNA介导的膀胱肿瘤基因沉默提供实验依据。

    【关键词】  siRNA　RNAi　膀胱肿瘤　survivin　细胞凋亡　基因沉默

　　A Study SiRNA Induced Survivin Gene Silencing on Cell Apoptosis in Human Bladder Cancer Cell Line BIU-87 in vitro

    CAO Zheng-guo1, ZHU Yu-ping1, ZHOU Si-wei2, et al.

    (1.Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001, China; 2.Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

    Abstract: ［Purpose］ To investigate the effects of siRNA (small interference RNA) on the cell apoptosis and survivin gene expression in human bladder cancer cell line BIU-87 in vitro. ［Methods］ With the software of Ambion Corporation, 3 specific siRNA targeted survivin gene were synthesized after designed and transcription in vitro. After siRNA were transferred into BIU-87 cells by liposome, MTT and TUNEL methods were used to detect the proliferation inhibitory rate (IR) and apoptosis index (AI) of BIU-87 cells, semi-quantitive reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Western Blotting techniques were used to examine the effects of siRNA on the expressions of the survivin gene and protein. ［Results］ The IR （41.84%, 56.21% and 54.13%）and AI (21.98%, 36.54% and 31.34%) of BIU-87 cell in the siRNA 1～3 group were respectively significantly higher than those in the control group(IR 1.98% and AI 3.17%) (P＜0.05). The expressions of survivin mRNA and protein in the siRNA groups were all lower than those in the control group. Moreover, the effects of siRNA2 and siRNA3 on inhibiting survivin expression, IR and AI of BIU-87 cells were stronger than siRNA1. ［Conclusion］ The siRNA of transcription in vitro can significantly inhibit the expression of survivin, induce cell apoptosis and inhibit the growth of BIU-87 cells which may provide the experimental evidence for the mechanism of the bladder tumor gene silencing therapy by siRNA.

    Key words: siRNA; RNAi; bladder neoplasms; survivin; cell apoptosis; gene silencing

    细胞凋亡在肿瘤的发生、发展和转移过程中起着重要作用。Survivin 是新近发现的凋亡抑制蛋白家族中作用最强的凋亡抑制因子，广泛存在于人的胚胎组织和大多数恶性肿瘤中，而在正常终末分化组织无表达[1]。研究表明survivin的抗凋亡作用是促进肿瘤细胞存活的主要机制之一,且其表达往往与肿瘤的恶性程度、预后密切相关，通过抑制survivin基因的表达不仅可诱导肿瘤细胞的凋亡，而且还可选择性增加肿瘤细胞对以凋亡为机制的治疗方法的敏感性[2]。

    RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术是近年来新兴的一种可以快速、高效的促使体内特定基因mRNA降解，实现基因转录后沉默的方法[3]。本研究通过设计合成针对survivin 基因的3个特异性siRNA，并将其转染人膀胱癌BIU-87细胞，观察siRNA对survivin表达和BIU-87细胞凋亡的影响。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂

    SilencerTM siRNA Construction Kit（体外转录试剂盒），Ambion公司；LipofectamineTM 2000（脂质体），Invitrogen公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT），Sigma公司；DNA原位末端标记（TUNEL）检测试剂盒，Boehringer Mannheim公司；Trizol，Gibco公司；TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)，大连宝生物工程有限公司；兔抗人survivin多克隆抗体，Dako公司；Western Blotting和ECL发光试剂盒，Pierce公司；siRNA模板和所有引物均由大连宝生物工程有限公司合成；人膀胱癌细胞株BIU-87由武汉大学典藏中心提供。

    1.2 方 法

    1.2.1 siRNA合成

    根据siRNA设计原则[4]和Ambion公司网站提供的软件（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）设计并合成针对survivin 基因（Gene Bank no. NM_001168）编码区的3个siRNA序列，siRNA1：Sense 5＇GGA CCA CCG CAU CUC UAC AUU 3＇，Antisense 5＇UGU AGA GAU GCG GUG GUC CUU 3＇；siRNA2：Sense 5＇ GCA CAA AGC CAU UCU AAG UUU 3＇，Antisense 5＇ ACU UAG AAU GGC UUU GUG CUU 3＇；siRNA3：Sense 5＇ CCU UCA CAU CUG UCA CGU UUU 3＇，Antisense 5＇ AAC GUG ACA GAU GUG AAG GUU3＇。siRNA模板合成后，根据体外转录试剂盒说明书进行操作。

    1.2.2 细胞培养和siRNA转染

 BIU-87细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃、5%的CO2孵箱内培养至对数生长期。用0.25%胰酶消化并调节细胞浓度以每孔106个细胞接种于6孔板中，实验分为siRNA1～3组并设置正常空白对照组，siRNA浓度均为20pmol，转染BIU-87细胞方法和步骤参照脂质体说明书进行。转染48h后进行后续操作。

    1.2.3 MTT法检测细胞增殖抑制率

    调节细胞浓度以每孔104个细胞接种于96孔板中，每组均设置5个复孔，并设空白对照组，培养24h。每孔加入MTT 20μl，孵育4h，终止培养，加入150μl DMSO，振荡10min。选择570nm波长，酶标仪测定各孔的吸光度值（A），计算各组BIU-87细胞生长增殖的抑制率（IR）：IR＝（A空白对照组－A实验组）/A空白对照组×100%

    1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡

    将细胞滴至盖玻片上，制备细胞爬片，PBS洗涤3次，室温下以4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤2次。凋亡检测程序参照TUNEL试剂盒说明书进行，以PBS代替TdT混合缓冲液作为阴性对照，细胞核呈棕褐色颗粒状着色为凋亡细胞。光镜下随机选择5个视野（×400），计数500个细胞并计算凋亡细胞总数所占的百分比，即为凋亡指数（AI）。

    1.2.5 半定量RT-PCR检测survivin mRNA表达水平

    800 r/min离心收集细胞，细胞总RNA的提取参照Trizol试剂的说明书进行。根据Primer Primier 5.0引物设计软件和BLAST分析设计survivin引物：Sense 5＇ CTTTCTCAAGGACCACCG 3＇，Antisense5＇ CTGTTACCAGCAGCACCC3＇，预计扩增产物为590 bp。同时设定内参照β-actin引物：Sense 5＇ GACTGCCTGCCTCACTTT3＇， Antisense 5＇ GCTGATCTCGGCTTCTGT 3＇，预计扩增产物为318 bp。RT-PCR二步法参照试剂盒的说明书进行，RT反应条件：55℃30min，99℃5min；PCR反应条件：94℃2min；94℃30s；60℃30s；72℃ 1.5min，循环30次。PCR反应结束后，取5μl扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用UVP-GDS 8000凝胶成像系统扫描并测定标本的灰度值，计算出每组survivin与β-actin的比值来判断survivin mRNA的相对表达水平。

    1.2.6 Western Blotting检测survivin蛋白表达强度

    用预冷的PBS洗涤细胞2次，加入5倍细胞悬液体积的组织蛋白裂解液，置冰上30min，12000 r/min离心2min。取上清10μl加入等体积的2×上样缓冲液混匀，煮沸10min，离心取上清。将变性后的总蛋白100μg经10% SDS-PAGE电泳，100V电泳至溴酚蓝达到凝胶底部。320mA恒流2h后将蛋白电转移到PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭2h，加入1：1000稀释的兔抗人survivin多克隆抗体，4℃孵育过夜。1：1000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG室温孵育1h，设立不加一抗的阴性对照组，ECL化学发光剂于暗室中曝光和显影，Western Blotting 蛋白条带测定光密度值，以表示survivin蛋白的相对表达强度。

    1.2.7 统计学分析

    数据用 x±s表示，以SPSS 11.5统计软件包进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析和S-N-K检验。

    2 结 果

    2.1 siRNA对BIU-87细胞的生长增殖抑制作用和凋亡的影响

    siRNA对BIU-87细胞的抑制率和凋亡指数（AI）影响结果见表1， siRNA1～3组均表现出对BIU-87细胞生长增殖的显著抑制作用，诱导BIU-87细胞发生明显凋亡，抑制率分别为41.84%、56.21%和54.13%，凋亡指数分别为21.98%、36.54%和31.34%，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），其中siRNA2和siRNA3作用最强，显著高于siRNA1（P＜0.05），siRNA2和siRNA3组间差异无显著性（P＞0.05）。

    2.2 siRNA对BIU-87细胞survivin mRNA表达

    水平的影响

    各组survivin 的RT-PCR凝胶电泳结果见图1，survivin mRNA的相对表达水平变化见表1。如图1所示，第1～4泳道分别是对照组和siRNA1～3组的survivin及其对应的β-actin扩增条带，其中survivin产物大小约为590 bp，β-actin产物大小约为318 bp。如表1 所示，对照组survivin mRNA的相对表达水平明显高于siRNA1～3组，siRNA1组survivin的表达水平也显著高于siRNA2和siRNA3组，siRNA2和siRNA3组间差异无显著性。

    2.3 siRNA对BIU-87细胞survivin蛋白表达的影响

    各组survivin蛋白的Western Blotting条带见图2，survivin蛋白的相对表达强度见表1。如图2所示，第1～4泳道分别是对照组和siRNA1～3组的survivin蛋白条带。如表1 所示，siRNA1～3组的survivin蛋白表达强度均显著低于对照组，siRNA2和siRNA3组的survivin表达强度也明显低于siRNA1组，siRNA2和siRNA3组间差异无显著性。

    3 讨 论

    RNAi是指真核细胞内一些短片段的双链RNA(double stranded RNA, dsRNA) 在胞浆dsRNA特异性核酸内切酶(dsRNA specific endonuclease，Dicer)的作用下裂解成具有21～23 nt碱基的短片段双链RNA分子，称之为siRNA（small interfering RNA），siRNA与核酶复合体结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)，RISC通过碱基配对方式与同源靶向mRNA结合后，从siRNA的3′端将靶向mRNA切割成小于12 nt的片段并使其降解[5]。此外，RISC与mRNA结合后还可在RNA依赖性RNA多聚酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRP)的作用下形成新的dsRNA；而切断后的mRNA被核酸外切酶降解后，在RdRP作用下也可形成dsRNA，dsRNA再次被Dicer降解形成新的siRNA进入上述过程，反复循环[6]。这种不断放大的瀑布式作用方式形成大量的siRNA，能在短时间内迅速有效地抑制靶基因表达。由于RNAi具有高效、特异性，且siRNA介导的转录后基因沉默是针对靶向基因的外显子序列，对其启动子或内含子序列却没有效应，是一种转录后基因表达调控机制，因而成为继反义核苷酸、核酶技术之后一种新的分析功能缺失表型的工具，为基因功能研究和基因治疗开辟了崭新的道路，且siRNA的引入避免了dsRNA对哺乳动物细胞的毒性反应和诱导非特异性的干扰素激活途径。因此，RNAi表现出了更高的特异性和可控性,且由于放大效应，其抑制目的基因的作用远高于反义核酸技术[7]。

Survivin基因定位于染色体17q25，全长14.7 Kb, 由3个内含子和4个外显子组成，编码142个氨基酸[8]。Survivin主要通过作用于各个凋亡途径的交合点直接或间接抑制凋亡终末效应器半胱氨酸蛋白酶Caspase-3及Caspase-7的活性、与周期蛋白激酶cdk4、p34cdc2相互作用阻断凋亡信号转导通路等这两条主要途径而阻断各种刺激因素诱导的细胞凋亡过程[9，10]，是联系细胞周期和凋亡界面的重要因子。我们的前期研究已证实survivin在膀胱移行细胞癌（BTCC）组织中的高表达与淋巴转移密切相关，同时和BTCC的病理分级有一定关系，而与患者的性别、年龄、临床分期、肿瘤直径和发生情况等均无相关性，提示survivin可作为一个肿瘤独立预后指标，而且与Bcl-2在BTCC细胞凋亡的调控方面起着协同作用。Shariaf等[11]研究表明检测膀胱癌患者尿中survivin的灵敏度和特异性明显高于尿细胞学检查，因而可作为临床筛选膀胱癌的一种简单、无创的检查方法。由于survivin具有选择性表达于恶性肿瘤组织的特性及其对维持肿瘤细胞生存的需求趋向，survivin被认为是恶性肿瘤治疗的一个重要靶点。

    目前以survivin为靶向的肿瘤基因治疗多采用反义寡核苷酸、反义RNA以及核酶技术进行抑制survivin表达的研究[12]。本研究针对survivin基因设计合成3条siRNA，通过脂质体转染人膀胱癌BIU-87细胞，研究其对survivin表达及其对BIU-87细胞凋亡的影响。研究结果表明siRNA1～3体外均能有效抑制survivin mRNA的转录，下调survivin蛋白质的表达，降低了survivin对Caspase-3及Caspase-7的抑制作用，抑制了survivin的抗凋亡作用，诱导和促进BIU-87细胞凋亡，从而抑制BIU-87细胞的生长增殖，其中以siRNA2和siRNA3作用效果最为显著，细胞抑制率和凋亡指数分别达到56.21%、54.13%和36.54%、31.34%，证明survivin是重要的细胞凋亡因子，可以作为肿瘤基因治疗的靶点，为siRNA介导的膀胱肿瘤基因沉默治疗提供实验依据。但siRNA在体内对survivin基因表达和膀胱癌细胞凋亡的影响有待于进一步研究。

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