Smac和Ki67在胃癌组织中的表达及其临床意义

　　作者：陈继红　　作者单位：武汉，湖北省肿瘤医院外科

　　【摘要】 目的 观察Smac和Ki67在胃癌中的表达，并探讨Smac表达与Ki67的关系及其临床意义。方法 应用免疫组织化学法检测71例胃癌组织中Smac和Ki67的表达，分析Smac表达与临床病理因素、预后及Ki67的关系。结果 Smac在胃癌组织中的表达率为71.8%(51/71)，在所有的癌旁组织中均见表达(20/20)。Ki67在胃癌组织中表达阳性率为66.2%(47/71)。Smac表达和Ki67表达与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期明显相关(P<0.05)。Ki67在Smac表达阴性的胃癌组织的阳性率(17/20)明显高于Smac表达阳性组(30/51，P<0.05)。Smac表达阳性患者的生存时间明显长于Smac表达阴性患者(P<0.05)。结论 Smac和Ki67可作为判断胃癌组织恶性程度和预后的指标之一，其中Smac的表达与Ki67的表达呈负相关。

　　【关键词】 胃癌 Smac Ki67 凋 增殖

　　胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国的发病率和死亡率均较高，其异常的细胞凋亡和增殖在胃癌的形成和进展中具有重要意义[1]。Smac是2000年在线粒体中发现的一种蛋白，可释放到胞浆中促进凋亡的发生[2]。Ki67是一种与增殖细胞相关的核抗原，是近年研究较多的反映肿瘤增殖活性的蛋白，其与肿瘤的增殖、浸润、转移潜能和预后密切相关[3]。本文旨在观察促凋亡蛋白Smac在胃癌中的表达情况并探讨其表达与增殖相关抗原Ki67的关系及其临床意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　随机收集71例我院1999年1月～2002年6月胃癌手术病例，有完整的临床病理学资料和随访资料，术前均未接受放疗或化疗。患者年龄为24～75岁，平均年龄为54.3岁。其中男47例，女24例。病理结果均经两名以上病理医师确认，按1999年WHO标准分类：腺癌49例，黏液腺癌12例，印戒细胞癌5例，未分化癌5例;肿瘤细胞组织学分化：高中分化38例，低分化或未分化33例。采用1997年UICC第5版胃癌TNM分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期25例，Ⅲ期29例，Ⅳ期12例。所有病例获得随访，随访时间8～81月，总体5年生存率为45.1%(32/71)。

　　1.2 试剂

　　鼠抗人Smac/Diablo单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)，兔抗人Ki67单克隆抗体(Lab Vision公司，美国)，即用型SP试剂盒(北京中杉生物公司)，DAB染色试剂盒(北京博奥森生物公司)等。

　　1.3 方法

　　取71例患者手术切除标本存档的石蜡组织块重新制作,4μm厚连续切片。每份标本常规苏木精伊红染色，进行组织形态学观察和细胞分化程度判断。SP法检测Smac、Ki67的表达。方法简述如下：石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化;柠檬酸缓冲液(pH6.0)95℃修复10min;3%H2O2室温孵育10min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后滴加非免疫性动物血清室温孵育15min，加一抗(抗Smac抗体1∶200，抗Ki67抗体1∶100)，4℃孵育过夜;PBS冲洗后滴加生物素标记二抗37℃孵育10min，辣根过氧化物酶标记抗生物素三抗37℃孵育15min,PBS冲洗后DAB显色，冲洗，苏木精复染，封片，显微镜观察并拍照。每次实验用已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。另随机选取本研究病例中距胃癌组织边缘至少5cm的癌旁黏膜组织标本(镜下未见癌细胞累及)20份做对照。

　　1.4 结果判定

　　(1)Smac染色的判断标准[4]：以胞浆染为淡黄或棕黄色定义为阳性细胞，随机选择5～10个高倍镜视野(×400)，每个视野计数500个细胞，阳性细胞数>30%的组织切片视为阳性标本。(2)Ki67染色的判定[3]：随机选择5～10个高倍镜(×400)视野进行计数，每个视野计数500个细胞，计算Ki67阳性细胞数占总细胞数的百分数，以阳性细胞数>20%视为阳性标本。

　　1.5 统计学处理

　　采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，样本间采用χ2检验，生存率采用KaplanMeier法分析并行Logrank检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 胃癌组织中Smac的表达

　　Smac表达于细胞浆内，呈淡黄色或棕黄色分布(图略)。71例中Smac表达阳性者51例，阳性率为71.8%，20例癌旁正常组织均为阳性表达。两者差异有统计学意义(P<0.05，χ2=5.67)。

　　2.2 Smac表达与临床病理指标的关系

　　Smac表达与性别无统计学意义(P>0.05),与癌细胞的分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期明显相关(P<0.05)，即Smac在低分化、T3和T4、有淋巴结转移、Ⅲ及Ⅳ期胃癌患者中的表达明显降低,见表1。表1 Smac表达与胃癌临床病理和预后的关系

　　2.3 Ki67在胃癌中的表达情况

　　Ki67表达于胃癌细胞核，呈棕黄色颗粒状(图略)，共47例(66.2%)胃癌患者Ki67表达阳性。本组胃癌Ki67表达与性别无统计学意义(P>0.05);与癌细胞的分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期明显相关(P<0.05)。

　　2.4 Smac表达与Ki67表达的关系

　　20例Smac表达阴性胃癌组织Ki67表达阳性为17例，51例Smac表达阳性组织中Ki67阳性者30例;统计学分析两者呈负相关(P<0.05，χ2=4.40)。

　　2.5 Smac表达与预后的关系

　　本组患者全部获得随访，总5年生存率为45.1%。生存时间大于5年的32例患者中Smac表达阳性者27例，生存时间小于5年的39例患者有24例阳性，统计学分析有明显差异(P<0.05)。经Logrank检验，Smac表达阳性患者的生存时间明显长于Smac表达阴性患者(见图1，P=0.002)。

　　图1 胃癌患者Smac表达情况

　　与术后特定时间生存率的关系

　　3 讨论

　　目前研究表明，肿瘤不仅是一种细胞凋亡异常的疾病，也是一种细胞增殖和分化异常的疾病，在致癌因子的作用下，细胞凋亡的抑制和(或)细胞增殖的增强是肿瘤形成、浸润和转移的生物学基础[1]。Smac是2000年首次报道在Hela细胞中分离出的一种线粒体蛋白，在凋亡信号刺激下与细胞色素C(cyt c)一同从线粒体中释放，可通过结合并活化apaf1以及结合并解除凋亡抑制蛋白(IAPs)对caspase3、7、9的抑制作用而发挥促凋亡作用[2,4]。有研究证实[46]，Smac N段多肽或其类似物或过表达Smac等可以促进多种形式诱导的凋亡而发挥抗肿瘤作用。

　　Smac在不同正常组织和肿瘤组织中表达各异。Yoo等[7]研究发现约62%的癌组织中可见Smac表达，约22%的肉瘤组织可见表达，且在不同的癌或肉瘤组织中Smac的表达有差异。包仕廷等[8]发现Smac在肝癌中低表达。Mizutani等[6]证实Smac在肾细胞癌中的表达下降，转染Smac cDNA可以增强TRAIL和顺铂介导的细胞毒作用。本研究证实约70%(51/71)的胃癌组织中Smac表达阳性，与Yoo等[7]研究基本一致。在随机选取的20例癌旁组织标本中均可见Smac表达。癌旁组织染色强度较部分胃癌组织为弱，这可能提示正常组织中多为正常的细胞凋亡，而胃癌组织中细胞凋亡减少，但存在部分凋亡过度活跃的细胞。且进一步分析表明Smac表达与癌细胞的分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有明显相关性，提示Smac表达可能在胃癌的发生发展中发挥重要作用。结果还显示Smac表达阴性患者5年生存率明显低于Smac表达阳性组，在生存时间少于1年患者中表现尤为明显，提示Smac还可能作为术后判断预后的辅助指标。Smac在胃癌中的表达减少，致使IAPs对caspase的抑制作用相对增加，凋亡过程被抑制，促进肿瘤细胞生长和转移。

　　Ki67是目前应用最广泛的增殖细胞指标之一，参与肿瘤的发生发展，可表达于除G0期外的所有细胞周期时相中。Ki67与胃癌关系的研究报道较多，但结论并不完全一致[3,9]。Czyzewska等[3]研究证实Ki67表达与肿瘤的分化程度、Lauren分型、淋巴结转移等明显相关，与年龄、肿瘤部位无关;Oshima等[9]的研究表明Ki67表达与年龄、性别、分期和预后等均无明显相关。本研究中超过60%(47/71)的患者表达阳性，进一步临床病理分析表明其与组织分化程度、分期和预后等有显著相关性，与Czyzewska等[3]研究一致。在Smac表达阴性的患者中Ki67表达阳性率高(17/20)，而Smac表达阳性患者的Ki67表达阳性率相对较低(30/51)，提示Smac的表达下降可能有促进胃癌细胞增殖的作用，可进一步定量分析其相关性。

　　总之，Smac在胃癌组织中的表达下降，可能通过抑制IAPs的活性降低胃癌细胞的凋亡，并促进肿瘤细胞的增殖;且Smac表达下降与组织分化程度、分期、预后相关，可作为判断胃癌的恶性程度和预后的辅助指标，并可能作为胃癌治疗的新靶点。

　　【参考文献】

　　[1] 陶凯雄,陈道达,王国斌,等.胃癌组织的细胞凋亡和增殖与其临床分期的关系研究[J].中华胃肠外科杂志,2001,4(2),108110.

　　[2] Du C,Fang M,Li Y,et al.Smac,a mitochondrial protein that promotes cytochrome cdependent caspase activation by eliminating IAP inhibition[J].Cell,2000,102(1): 3342.

　　[3] Czyzewska J,GuzińskaUstymowicz K,Lebelt A,et al.Evaluation of proliferating markers Ki67,PCNA in gastric cancers[J].Rocz Akad Med Bialymst,2004,49(Suppl 1):6466.

　　[4] Hasenjager A,Gillissen B,Muller A,et al.Smac induces cytochrome c release and apoptosis independently from Bax/BclxL in a strictly caspase3dependent manner in human carcinoma cells[J].Oncogene,2004,23(26):45234535.

　　[5] Li L,Thomas RM,Suzuki H,et al.A small molecule Smac mimic potentiates TRAIL and TNFαmediated cell death[J].Science,2004,305(5689):14711474.

　　[6] Mizutani Y,Nakanishi H,Yamamoto K,et al.Downregulation of Smac/DIABLO expression in renal cell carcinoma and its prognostic significance[J].J Clin Oncol,2005,23(3):448454.

　　[7] Yoo NJ,Kim HS,Kim SY,et al.Immunohistochemical analysis of Smac/DIABLO expression in human carcinomas and sarcomas[J].APMIS,2003,111(3):382388.

　　[8] 包仕廷,桂水清,林木生,等.Smac和Survivin基因在肝癌中的表达及与细胞凋亡的关系[J].中华实验外科杂志,2005,22(9):10621063.

　　[9] Oshima C,Iriya A,Forones NM.Ki67 as a prognostic marker in colorectal cancer but not in gastric cancer[J].Neoplasma,2005,52(5): 420424.