反义核酸诱导治疗白血病的研究进展

　　作者：李建厂,综述,徐酉华,审校　　作者单位：重庆医科大学附属儿童医院，重庆 400014

　　【摘要】反义技术是近年发展起来的一门治疗肿瘤的新技术，已成为医学界研究的热点之一，许多反义药物已开始进入临床实验阶段，并取得了令人满意的疗效。文章主要综述了反义技术的作用机制，在白血病方面所选用的靶基因以及研究进展。

　　【关键词】 反义核酸　白血病

　　肿瘤细胞因其自身的生长特性而有一些特异表达的基因，这些基因在正常细胞不表达或表达程度很低，因而针对这些基因的反义药物在治疗肿瘤时对正常组织不产生或仅产生较小的副作用。目前选择的抗肿瘤反义药物的靶点主要有：①癌基因类：c?鄄myc、c?鄄myb，bcl?鄄2，N?鄄Ras，K?鄄Ras，H?鄄Ras，c?鄄un，c?鄄fos，cdc?鄄2，c?鄄mos等。②宿主基因类：如多药耐药基因、细胞周期素、前胸腺素、T细胞受体、表皮生长因子受体、蛋白激酶C等。③细胞因子类：如IL?鄄2，IL?鄄1α，IL?鄄1β等[1]。在白血病方面，被研究的基因主要有以下方面。

　　1　癌基因类

　　1.1　Bcl?鄄2

　　目前的研究已表明：bcl?鄄2基因是一个耐药和抗凋亡基因。bcl?鄄2蛋白表达的高低与肿瘤细胞对多种化疗药物敏感性密切相关，bcl?鄄2基因的过度表达可明显降低化疗药物引起的细胞凋亡。Zhang等[2]将三氧化二砷与bcl?鄄2的反义寡核苷酸联用，作用于K562和NB4细胞，结果发现反义寡核苷酸能明显促进白血病细胞系对三氧化二砷的敏感性。

　　Bcl?鄄2的过表达被认为是白血病耐药、预后差的重要原因之一，那么，降低bcl?鄄2的表达，则可部分逆转其耐药，增加缓解率。根据这一设想Marcucci等[3]利用bcl?鄄2反义寡核苷酸药物G3139进行了临床实验，病人共20例，包括难治及复发的急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞性白血病。采用G3139与氟达拉滨、阿糖胞苷及粒细胞集落刺激因子联合用药，9例病人对治疗有反应，其中6例取得完全缓解，3例部分缓解;在12例可评价的病人中，9例bcl?鄄2 mRNA水平下调，此项研究证实，bcl?鄄2反义寡核苷酸能够在治疗白血病中起到积极作用。已有研究证实，针对bcl?鄄2 mRNA翻译起始部位的反义寡核苷酸(AS?鄄ODN)可抑制许多肿瘤细胞中bcl?鄄2的表达，促进细胞凋亡，提高肿瘤细胞对化疗的敏感性[4]。

　　1.2　Bcl?鄄xL

　　Bcl?鄄x mRNA前体经过不同的剪接可产生两种不同的mRNA，表达产物分别为抗凋亡的Bcl?鄄xL和促凋亡的Bcl?鄄xS。近来的一些研究报道提出凋亡抑制蛋白Bcl?鄄xL和许多常见恶性肿瘤的化疗耐药有密切关系。在体外转染针对Bcl?鄄xL基因的ASODN以后，能够诱导多种恶性肿瘤细胞凋亡，或促进其对化疗药物的敏感性。 Broome等[5]进行了Bcl?鄄xL的反义寡核苷酸作用于急性T淋巴细胞性白血病细胞系CEM的研究，经反义寡核苷酸干预18h后，与对照组相比，CEM细胞的Bcl?鄄xL蛋白表达及活细胞计数均明显降低，联合应用地塞米松或阿霉素则作用效果更为明显，结果证实Bcl?鄄xL反义寡核苷酸具有细胞毒活性，能够增强化疗药物诱导的白血病细胞死亡。

　　1.3　c?鄄myb

　　c?鄄myb基因属于癌基因的一种，与细胞周期进展有关。c?鄄myb蛋白水平随细胞周期的进程而短暂升高。在细胞终末分化阶段c?鄄myb的表达迅速下降。c?鄄myb的表达能阻断正在分化的骨髓细胞成熟。Luger 等[6]用c?鄄myb的反义寡核苷酸对部分慢性粒细胞白血病病人在自体骨髓移植前进行骨髓净化，提取CD34(+)骨髓细胞，用c?鄄myb的反义寡核苷酸净化24h(19例)或72h(5例)，检测c?鄄myb mRNA发现其表达水平下降大约50%，细胞经长期原代培养，检测bcr/abl发现超过50%的病人取得了完全的净化，第100d细胞遗传学检测发现，尽管自体移植前100%的病人呈Philadelphia染色体阳性，但移植后有6/14的病人有细胞遗传学改变，其中1例获得完全细胞遗传学缓解，3例Philadelphia(+)病人细胞降至33%以下，与对照组相比效果明显。

　　2　凋亡抑制蛋白家族

　　肿瘤的发生发展与细胞的凋亡受阻密切相关，许多凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员已成为基因治疗的有效靶点。Survivin是1997年发现的一种新的凋亡抑制基因，定位于17q25上，广泛地表达于胚胎发育组织以及多数人类肿瘤细胞，在正常分化成熟组织中未见表达。Survivin以细胞周期依赖特异性表达于G2/M期，参与有丝分裂过程中纺锤体的形成，保持有丝分裂的真实性，从而使细胞顺利通过G2/M期。研究表明Survivin基因在胚胎发育及肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用。大多数白血病细胞表达Survivin基因，而正常骨髓细胞均不表达Survivin。由于Survivin在肿瘤细胞中的特异性表达，使它在理论上成为反义基因治疗肿瘤的一个新靶点。Olie等针对Survivin mRNA设计6条ASODN，然后应用荧光定量PCR筛选到下调mRNA作用最强的ASODN4003[7, 8]。王晓娟等[9]将Survivin基因反义核酸通过电穿孔的方法转染入白血病细胞系HL?鄄60，发现Survivin mRNA的表达下降，进一步与紫杉醇联用发现Survivin反义核酸能够增加HL?鄄60细胞的凋亡。

　　3　端粒酶

　　端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物，含有端粒重复序列的模板，能以自身RNA为模板，复制合成端粒重复序列，对维持细胞的生存起着极其重要的作用。研究表明在人体大部分正常组织中没有端粒酶活性表达，仅在胚胎细胞、睾丸、卵巢、肝细胞、造血干细胞及正常白细胞等部分细胞中有端粒酶很弱的表达，与之相反，约有85%的肿瘤细胞表达较高的端粒酶活性。这说明端粒酶激活在大多数肿瘤细胞中普遍存在，端粒酶可能参与了肿瘤的发生发展。端粒酶由三部分组成：人端粒酶催化亚单位(hTERT)，人端粒RNA(hTR)，端粒酶相关蛋白(TP1)。Yuan等将端粒酶HTERT反义寡核苷酸与CDDP 联合作用于HL?鄄60 及K562细胞，发现该反义寡核苷酸能增加HL?鄄60及K562对CDDP的敏感性，诱导这两种细胞系的凋亡。之后，他们又对急性及慢性髓细胞性白血病病人的白血病细胞进行类似实验，结果也证实端粒酶HTERT反义寡核苷酸能够促进白血病细胞对CDDP的敏感性[10, 11]。

　　4　蛋白激酶C

　　蛋白激酶C(PKC)是丝?鄄苏氨酸蛋白酶家族，参与信号传导系统，调控生长因子应答，控制细胞增殖和凋亡，与肿瘤的发生发展有关。因此，PKC成为抗肿瘤治疗的靶点。Thonel A等[12]用蛋白激酶C反义核苷酸作用于AML细胞，发现单独应用反义核酸对白血病细胞作用有限，但如果与化疗药物联合应用却能取得让人满意的结果。

　　5　耐药基因类

　　肿瘤细胞耐药是化疗失败的一个重要原因，各方学者都在探讨逆转肿瘤细胞耐药的方法，这些方法多在P?鄄gp水平起作用，且副作用较大。从基因水平逆转其耐药便成为研究热点方向。多药耐药基因(MDR1)在肿瘤耐药中起了重要的作用。Wei等[13]试验用反义技术逆转其耐药，他们采用耐阿霉素的K562细胞(K562/ADM)系作为研究对象，以针对MDR1的核酸肽和反义寡核苷酸作用于K562/ADM，结果发现，单独的核酸肽和反义寡核苷酸对K562/ADM的增殖没有抑制作用，而与阿霉素共同作用时则产生明显的抑制作用，K562/ADM细胞内阿霉素的浓度明显增高，P?鄄gp表达下调。

　　6　血管内皮生长因子

　　血管内皮生长因子(VEGF)是一种促血管形成因子，在体外能够诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，在体内能够促进血管新生。血液系统肿瘤也存在血管新生现象，瘤细胞过量表达VEGF，骨髓微血管密度增加。研究显示VEGF能促进白血病的发生发展，还与预后有关。因此抑制VEGF表达可能成为血液肿瘤治疗的一项新措施[14]。Ruan等[15]分别将VEGF正义核苷酸与反义核苷酸转染入白血病细胞系K562，检测细胞的增殖与凋亡，结果发现转染反义核苷酸的K562细胞VEGF分泌下降49%，而转染正义核苷酸的K562细胞VEGF分泌上升3倍;他们还进一步进行了动物实验，将转染反义核苷酸的K562细胞接种至裸鼠，结果肿瘤微血管密度较对照组减低，而且如果在INFα存在的情况下细胞凋亡加速。

　　7　细胞周期类

　　细胞周期素(cyclins)是特定时相短暂出现的基因表达产物，是细胞周期素依赖性激酶(CDK)的基本激活亚基，对细胞通过细胞周期调控点(cell?鄄cycle checkpoints)的调节上起关键性作用。目前已发现Cyclin A?鄄I 9个成员。细胞周期的紊乱将导致无限制的细胞分化，这是肿瘤发生的原因之一。实验研究发现，在体外以脂质体作为载体将细胞周期素A (Cyclin A)反义核苷酸转染入白血病细胞系HL?鄄60细胞，HL?鄄60细胞生长较对照组明显降低，细胞出现明显的凋亡特征。cyclin G1作为一种新的细胞周期素，在细胞的生长过程中起着一定作用[16]。利用细胞周期素G1(cyclin G1)反义硫代脱氧寡核苷酸对HL?鄄60细胞在裸鼠体内生长的抑制作用研究发现，cyclin G1蛋白的表达明显下降，裸鼠体内HL?鄄60细胞的生长受抑，且有部分细胞出现凋亡[17]。

　　近十几年来，反义技术的迅速发展，已成为医学界研究的热点领域之一，许多反义药物已进入临床实验，并取得了一定的疗效，这为白血病以及其他恶性肿瘤的诊治带来了新的希望。但同时我们也应看到反义治疗技术还处在起步阶段，还存在不少问题，比如转染效率不够高，特异性及稳定性还有待解决等。我们有理由相信，随着科学技术的飞速发展，这些问题将被逐步解决，由于反义技术的独特优势，它必将成为治疗肿瘤的有力手段。

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