G3BP在喉鳞状细胞癌的表达及其临床意义

　　作者：徐志坚，彭解人，黄晓明 作者单位：1. 中山大学附属第二医院耳鼻咽喉科， 广州 510120; 2. 惠州市中心人民医院， 广东 惠州 516001

　　【摘要】 　　目的 研究GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白(G3BP)在喉鳞癌组织中的表达情况及其与喉鳞癌生物学行为之间的关系。方法 采用免疫组织化学方法检测91例喉鳞癌组织中G3BP的表达情况，并探讨他们与喉鳞癌的肿瘤组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移和预后的关系。结果 G3BP在喉鳞癌的阳性表达率为84.7%。其表达水平与肿瘤分化程度(P=0.008)、临床分期(P=0.005)、淋巴结转移(P=0.000)及肿瘤复发转移(P=0.000)均有密切关。G3BP表达水平越高，患者术后生存时间越短(P=0.000)。结论 G3BP在喉鳞癌表达与肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移、肿瘤复发转移情况及患者的预后有密切关系。G3BP可作为判断喉鳞癌患者预后的有效参考指标。

　　【关键词】 喉鳞状细胞癌 GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白 免疫组织化学

　　in laryngeal squamous cell carcinoma and it clinical significance

　　XU Zhijian1,2，PENG Jieren1, HUANG Xiaoming1, GUAN Zhong1, ZHU Xiaofen2, LIAO Yanping2

　　(1. Department of Otolaryngology, Affiliated Second Hospital of Sun Yetsen University, Guangzhou 510120, China;

　　2. Huizhou Central People′s Hospital, Huizhou 516001, Guangdong, China)

　　To investigate the expression of the RasGTPaseactiviting protein SH 3 domain binding protein(G3BP) in laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC) and to explore its correlation with biological behavior. Methods The expressions of G3BP in 91 cases of LSCC were determined by immunohistochemistry. The relationships between protein expression and tumor size, differentiation degree, TNM stage, lymph node metastasis and prognosis of LSCC were explored. Results The positive expression rate of G3BP in LSCC was 84.7%. The G3BP expression level was correlated with the degree of differentiation of tumors(P=0.008), clinical stage(P=0.005), lymphatic metastasis(P=0.000),　and tumor recurrence or distant metastasis(P=0.000), and also the expression of G3BP was significantly related to survival in a negative timedependent manner in LSCC patients(P=0.000). Conclusions The expression of G3BP is related to the degree of differentiation of tumors， clinical stage, tumor recurrence or distant metastasis, lymphatic metastasis and survival in LSCC patients. Overexpression of G3BP may be used as a prognostic marker for overall survival of LSCC patients.

　　Key words: Laryngeal squamous cell carcinoma; RasGTPaseactiviting protein SH 3 domain binding protein; Immunohistochemistry GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白(RasGTPaseactiviting protein SH 3 domain binding protein，G3BP)是一种与淋巴结转移、肿瘤分化程度、临床分期及术后的复发转移都密切相关的蛋白，可能广泛 地参与肿瘤的发生发展过程。本研究旨在了解G3BP在喉鳞癌组织中的表达情况,结合随访资料探讨其与喉鳞癌生物学行为之间的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料 研究对象为中山大学附属第二医院耳鼻喉科2000年1月至2003年6月收治的喉癌患者。研究入选标准：①初诊为喉鳞癌，分期方法采用2002年国际抗癌联盟(UICC)喉癌分期标准，以纤维喉镜、影像学资料及术后病理分期为依据;②术前未行其它治疗，全部行手术治疗，部分术后辅以放化疗;③入选病例均有完整临床及病理资料，包括性别、年龄、分期、接受治疗情况、疗效及复发情况等。

　　符合入选标准的病例共91例，随访截止时间为2008年3月，其中失访6例，随访率为93.41%。85例患者中男81例，女4例，37～80岁，平均(62.58±10.22)岁。按UICC(2002)分期Ⅰ期31例，Ⅱ期19例，Ⅲ期15例，Ⅳ期20例。另取同期行手术治疗的声带息肉标本13例作对照研究。

　　1.2 方法

　　1.2.1 主要试剂 鼠抗人G3BP单克隆抗体(北京大学医学部病理学系)、二步法免疫组化检测试剂盒(PV6002)(北京中衫金桥生物公司)、浓缩型DAB试剂盒(北京中衫金桥生物公司)。

　　1.2.2 方法及结果判断 采用SP免疫组化二步法,具体步骤略。G3BP表达于细胞浆(呈棕黄色)。结果判断，每张切片由两名观察者双盲交换判断，免疫组织化学切片肿瘤显色计分：A.细胞浆无显色，0分(0)，B.胞浆呈淡黄色云雾状，1分(+)，C.胞浆呈黄色颗粒状，2分

　　2 结 果

　　2.1 G3BP在喉癌及声带息肉中的表达情况 在85例喉鳞癌组织中G3BP呈阳性表达的有72例，阳性表达率为84.7%(见图1)。其中表达水平为低表达的有52例，高表达的有20例。而在13例声带息肉组织中G3BP的表达均为阴性(见图2)。

　　2.2 G3BP在喉鳞癌组织中的表达与临床及病理指标的关系 G3BP的表达与肿瘤分化程度(P=0.041)、临床分期(P=0.002)、淋巴结转移(P=0.000)及肿瘤复发转移(P=0.000)均相关。详见表1。 G3BP在喉鳞癌组织中的表达与患者生存时间的关系

　　2.4 多因素对生存时间的影响COX回归分析 影响喉鳞癌患者生存时间因素采用COX回归分析。单因素分析，对患者生存时间有影响的因素有：临床分期、分化程度、放疗、淋巴结转移、及G3BP的表达情况。多因素逐步回归分析后进入回归方程的影响因素只有：临床分期、 (P=0.010)、分化程度(P=0.021)及G3BP的表达情况(P=0.048)。见表2。

　　3 讨 论

　　Ras基因首先在Harvery鼠肉瘤病毒(HaMSV)和Kirsten鼠肉瘤病毒(KiMSV)的子代基因中被发现。经十余年研究已证实Ras信号转导途径在细胞增殖、分化、细胞骨架构建、恶性转化、肿瘤侵袭转移等多种极为重要的生物学过程中发挥作用[1]。有学者认为，ras蛋白有活化和非活化两种形式，通常情况下，胞内的ras蛋白分子处于非活化状态。在此种状态下的 ras蛋白特征是具有能够与GDP相结合的构象。在它们受到信号传递通道上游某一外界因子的刺激时，便使GDP变成GTP，随后ras蛋白发生构象改变，转变成为其活化状态。活化的ras蛋白与效应分子相互作用，实现生长信号的传递。在这种作用发生后，活化的ras蛋白会迅速失活，转变为与GDP结合的非活化形式。

　　G3BP是1996年在法国RhonePoulenc Rorer实验室于由Parker F等从生长状态的中国仓鼠肺成纤维细胞中首次克隆[2]。有研究[34]发现, RASGAP的SH3结构域对于信号转导途径发挥作用是必不可少的,而且还能以RAS非依赖方式调节Rho介导的细胞骨架重建以及细胞凋亡。G3BP是第一个被证实与GAP的SH3功能区牢固结合的分子,当ras处于激活状态时，GAPG3BP复合物形成。进一步研究发现，细胞只有处于生长状态下,G3BP才能与RasGAP结合,并且这种结合具有RasGTP依赖性。G3BP是一种多功能分子，近些年来国外各实验室的工作集中于G3BP生化功能的研究。Gallouzi等[5]研究发现，G3BP具有RNase活性，能够特异性降解cmyc mRNA的3′非翻译区多个位点;Costa等[6]在对人类细胞解旋酶进行系统性研究过程中发现，G3BP为一种具有对自身ATP酶活性和Mg2+依赖性的DNA解旋酶Ⅷ(HDH Ⅷ)。Guitard等[7]将G3BP瞬时转染至NIH3T3细胞，发现G3BP能够促进细胞进入S期。

　　宁钧宇等[8]成功制备的特异性G3BP单克隆抗体，并采用ELISA、Western蛋白免疫印迹以及免疫组织化学染色ABC法对不同样本的G3BP 蛋白表达水平进行检测。结果显示，G3BP在肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等临床肿瘤活检组织中的表达明显增高。并且在乳腺癌的研究中发现，G3BP的表达水平与淋巴结转移呈正相关。在头颈部鳞癌的研究中，张惠忠等[9]检测80例食管鳞癌组织中G3BP的表达，并对患者进行长期随访。研究结果显示，G3BP的表达与淋巴结转移呈正相关，与患者术后生存时间呈负相关。

　　本研究结果显示，G3BP的表达与淋巴结转移、肿瘤分化程度、临床分期及术后的复发转移都密切相关，且G3BP的表达阳性的患者其术后生存率明显低于阴性表达的患者。上述结果提示，G3BP在喉鳞癌的发生、浸润发展及淋巴转移过程中发挥着重要作用。其具体作用可以推测为：G3BP作为接头蛋白，通过与GAPSH3功能区的牢固结合,将RNA降解与上游信号分子联系起来,从而影响某些蛋白的RNA稳定性和翻译的有效性，既导致Ras蛋白与GTP的解离减少，Ras蛋白活化形式所占比例增高;处于活化状态的Ras蛋白持续地激活PLC产生第二信使,造成细胞不可控制地增殖、恶变而形成肿瘤。

　　总之，与其它系统恶性肿瘤一样，喉鳞癌的发生发展和转移是多因素、多步骤、多阶段的复杂的过程。本实验仅仅从蛋白水平探讨了G3BP在喉鳞癌组织中的表达情况及其与临床、病理指标的关系。并且由于本研究入选病例有限，进一步明确的结论有待大宗病例、多中心、前瞻性研究证实。

　　【参考文献】

　　[1] Waldmann V, Rabes H M. What′s new in ras genes Physiological role of ras genes in signal transduction and significance of ras gene activation in tumorigenesis[J]. Pathol Res Pract, 1996, 192(9):883891.

　　[2] Parker F, Maurier F, Delumeau I, et al. A RasGTPaseactivating protein SH3domainbinding protein[J]. Mol Cell Biol, 1996, 16(6):25612569.

　　[3] Leblanc V, Tocque B, Delumeau I. RasGAP controls Rhomediated cytoskeletal reorganization through its SH3 domain[J]. Mol Cell Biol, 1998, 18(9):55675578.

　　[4] Leblanc V, Delumeau I, Tocque B. RasGTPase activating protein inhibition specifically induces apoptosis of tumor cells[J]. Oncogene, 1999, 18(34):48844889.

　　[5] Gallouzi I E, Parker F, Chebli K, et al. A novel phosphorylationdependent RNase activity of GAPSH3 binding protein a potential link between signal transduction and RNA stability[J]. Mol Cell Biol, 1998, 18(7):39563965.

　　[6] Costa M, Ochem A, Staub A, et al. Human DNA helicase VIII:a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway[J]. Nucleic Acids Res, 1999, 27(3):817821.

　　[7] Guitard E, Parker F, Millon R, et al. G3BP is overexpressed in human tumors and promotes S phase entry[J]. Cancer Lett, 2001, 162(2):213221.

　　[8] 宁钧宇,由江峰,裴斐,等.G3BP单克隆抗体制备及G3BP在肿瘤组织中表达的检测[J].中华病理学杂志.2005,34(4):215219.

　　[9] Zhang H Z, Liu J G, Wei Y P, et al. Expression of G3BP and RhoC in Esophageal Squamous Carcinoma and their effect on prognosis[J]. World J Gastroenterol, 2007, 13(30):41264130.