肿瘤热疗用纳米磁性材料的生物相容性评价方法研究进展

　　作者：刘静，张东生 作者单位：(东南大学医学院 病理学与病理生理学系，江苏省生物材料和器件重点实验室，江苏 南京 210009)

　　【摘要】 纳米磁性材料的生物相容性检测是其应用于肿瘤热疗技术的前提之一。纳米磁性材料能否用于人体,必须考察其是否具有良好的生物相容性。生物相容性一般包括细胞相容性、组织相容性和血液相容性3个方面。作者就生物相容性的概念、生物相容性的3个方面及生物相容性评价工作中存在的问题对肿瘤热疗用纳米磁性材料生物相容性评价方法的新进展进行综述。

　　【关键词】 纳米磁性材料; 生物相容性; 评价方法; 文献综述

　　随着人们生活水平的不断提高，恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的劲敌。各种报道和调查显示[1]，全世界每年新发现的肿瘤患者多达1 090万，而且肿瘤的发病率持续上升，成为仅次于心血管疾病的第二大致死原因。但是，目前临床上对肿瘤的治疗手段仍然十分有限，预后也比较差。肿瘤磁感应热疗[2-5]是一种新型的肿瘤治疗手段，它通过各种方法将纳米磁性材料精确地分布于肿瘤组织中，在外加交变磁场的作用下,纳米材料感应发热，使肿瘤组织达到一定的温度，从而达到治疗肿瘤的效果。有研究表明[6]，肿瘤细胞在高温的环境下对放射线更为敏感。研究发现[7],越小的纳米颗粒越有可能穿透细胞并产生毒性作用。所以，纳米磁性材料能否用于人体,首先必须考察其是否具有良好的生物相容性。

　　生物相容性一般包括细胞相容性、血液相容性和组织相容性3个方面。下面就生物相容性的概念、生物相容性的3个方面及生物相容性评价工作中存在问题的研究进展作一综述。

　　1 生物相容性的概念

　　相容性[8]是指两种或两种以上的体系共存时互相之间的影响。如果这些体系在共存时互不影响，互不损伤，互不破坏，就可以说这些体系间有完全的相容性。如果这些体系在共存时相互影响，相互破坏，导致不能长期共存时，就可以说这些体系之间的相容性差或没有相容性。生物相容性[9]是指任何一种外源性物质，包括天然材料[10]、治疗用的外源性细胞、植入的器官、人工材料的植入体或纳米粒子，为治疗目的植入或通过某种方式进入生物体，或与生物组织共存时，对生物体和生物组织造成损伤，或引起生物体、生物组织发生反应的能力和性质，和(或)生物体容许这种材料在体内存在及与这种材料的相互作用的能力和性质。普遍认为生物相容性包括两大原则[11]：一是生物安全性原则即消除生物材料对人体的破坏性;二是生物功能性原则(或称为机体功能的促进作用)，指其在特殊应用中“能够激发宿主恰当地应答”的能力。纳米材料对于宿主是异物，在体内必定会产生某种应答或出现排异现象。纳米材料要使发生的反应能被宿主接受，不产生有害的作用，因此要对纳米材料进行生物安全性评价，即生物学评价。对纳米磁性材料进行生物相容性评价是纳米磁性材料能否进入临床研究的关键环节[12]。

　　2 细胞相容性评价

　　细胞相容性[13]是材料对细胞的生长、附着、增殖及代谢功能的影响，以存活的有功能的细胞或(和)细胞生长增殖情况作为材料的生物相容性评价指标。常用的细胞相容性评价实验方法有 MTT试验、流式细胞光度术等。一般选用L929细胞和HeLa细胞来进行试验，这两种细胞[14]具有传代容易、繁殖迅速、体外培养条件低、易储存，同时这两种已建立成系的细胞株能为实验提供稳定传代的细胞、能为许多材料细胞毒性评价所共用等优点，1982年美国质量标准协会将L929细胞推荐为细胞毒性试验中的标准细胞。

　　2.1 MTT试验

　　MTT试验是大部分磁性介质生物相容性评价工作采用的基本试验项目。它是一种比较准确、快速和简便、可作定量评价的常用方法，现已广泛应用于医用材料的生物学评价。其原理是活细胞中的线粒体脱氢酶将MTT分子还原产生紫色结晶物，紫色结晶物形成数目的多寡与活细胞数目和功能状态呈正相关，用DMSO溶解结晶后，在酶联免疫检测仪上测吸光度，即可代表细胞数量。将测得的吸光度带入细胞相对增殖率的公式来计算。细胞相对增殖率(RGR)= 实验组OD均值/阴性对照组OD均值×100%。把RGR值转换成6级反应[15]：0级反应RGR值为≥100%，1级反应RGR值为75%～99%，2级反应RGR值为50%～74%，3级反应RGR值为25%～49%，4级反应RGR值为1%～24%，5级反应RGR值为0。实验结果是0或 1级反应为合格，实验结果是2级反应需要结合细胞形态综合评价，实验结果是3～5级反应为不合格。

　　目前已进行过细胞学评价的纳米磁性材料有纳米Fe2O[15]3、纳米Fe3O[16]4、纳米镍铜热籽[17]、纳米Mn0.5Zn0.5Fe2O[18]4等。例如颜士岩等[15]研究指出，不同浓度的Fe2O3纳米磁性粒子浸提液作用于L929细胞72 h 后，其细胞RGR分别为91.3%、76.9%、76.6%、81.9%，依相对增殖率与毒性分级转换表标准判定不同浓度的Fe2O3纳米磁性粒子浸提液其细胞毒性均为1级，均属对细胞无毒性范畴，而阳性对照组0.7%的丙烯酰胺单体溶液的细胞RGR为11.6%，其毒性评定为4级，为不合格生物材料，证实其自制的F2O3纳米磁性粒子体外试验无细胞毒性作用。该法简便迅速、不接触同位素、敏感性高，缺点是紫色结晶物有时易聚集成团影响结果的准确性[19]。

　　2.2 流式细胞光度术(flow cytometry，FCM)[20]

　　该法利用鞘流原理，使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单列，按重力方向流动。细胞被激光照射后发射荧光，检测器可逐个对细胞的荧光强度进行测定，常用来检测细胞周期和细胞凋亡。邓凌燕[21]研究发现，随着Fe3O4磁微粒浸提液干预浓度的增高，肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的凋亡率无增高的趋势，差异无统计学意义(P>0.05)。证实不同浓度Fe3O4磁微粒浸提液对肺泡上皮细胞和人血管内皮细胞凋亡无影响。FCM法能提供具体明确的凋亡率值，为评价凋亡提供客观的数值指标，同时可为分析材料对细胞周期的影响提供证据。

　　2.3 乳酸脱氢酶(LDH)试验[22]

　　LDH定位于细胞胞浆内。一般情况下，LDH不能透过细胞膜。当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比。这一方法已被用来检测碳纳米管的细胞毒性[23-24]。王晓娜等[25]发现，随着Fe2O3纳米颗粒作用浓度的升高(267.5、535、1 070 μg·ml-1)，可致细胞内LDH漏出量增加。此法通过检测细胞培养液上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度。

　　2.4 单细胞凝胶电泳技术检测细胞DNA损伤

　　单细胞凝胶电泳又称彗星实验，由Singh等[26]和Ostling等[27]在中性凝胶电泳技术基础上改进和建立，是检测单个细胞DNA链断裂的实验方法，该方法具有灵敏、简便、快速、样品用量少及不需放射性等优点。李倩等[28]运用单细胞凝胶电泳技术检测发现，纳米Fe2O3可造成小鼠肝、脾、肾组织细胞、外周血细胞和骨髓细胞的DNA断裂，其研究表明DNA断裂与细胞的氧化损伤有密切关系。Lacava等[29]发现，磁流体还可以致小鼠发生炎症反应，导致巨噬细胞内氧自由基和氧化亚氮的生成，从而造成DNA损伤。

　　除此之外，还有一些研究者进行过其他相关实验，如体外CHI细胞染色体畸变试验[30]DNA合成检测方法、细胞膜完整性测定、人工计算细胞数[1]等细胞相容性试验。

　　3 血液相容性评价

　　血液相容性试验[31]通过生物材料和医疗器械与血液相接触(体外、半体内或体内)，评价其对血栓形成、血浆蛋白、血液有形成分和补体系统的作用。通过对材料与血细胞体外接触过程中所致红细胞溶解和血红蛋白游离程度的测定，对材料的体外溶血进行评价，能敏感地反映试样对红细胞的影响，在生物安全性评价中起重要作用。

　　体外溶血试验是鉴定血液相容性最基本方法之一[32]，它不仅可以评价样品的体外溶血性，还可以敏感地提示样品的毒性。Zhang等[33]通过体外溶血试验发现，Fe3O4纳米磁性粒子的溶血率为0.514%，远小于5%，表明实验用Fe3O4纳米磁性粒子无溶血作用，符合医用材料的溶血试验要求。Zhang等[34]研究发现MgZnMn合金的溶血率高达65.75%。Li[35]研究发现单纯的镁溶血率是59.3%。因此说溶血试验在生物安全性评价中起着重要的作用。

　　由于体内环境的复杂性及多变性和血凝机理，ISO标准中也只能提出一个评价方向的基本要求，到目前为止还没有建立一套相关的评价标准。新近研究建立的新方法[36]有血小板黏附及血小板消耗量、复钙时间、凝血因子Ⅳ、血浆总蛋白和球蛋白计数等诸多方面的血液相容性试验方法，但对纳米磁性材料进行定量化的评价有一定的难度，需要不断成熟和完善,将其标准化。

　　4 组织相容性评价

　　组织相容性[37]是指生物材料与人体组织接触后，在材料组织界面发生一系列相互作用，最终被人体组织所接受的性能。常用的组织相容性试验有体内植入试验、微核试验、肝脏穿刺试验等。

　　4.1 体内植入试验

　　植入试验[31]将生物材料和医疗器械植入动物的合适部位，如皮下、肌肉和骨，在观察一定时期(短期为7、15、30、60、90 d，长期为180、360或720 d)后，评价对活体组织局部毒性作用。主要通过病理切片观察组织的变化。根据产品使用部位可选择皮下组织植入试验、肌肉植入试验或骨内植入试验。体内植入试验可从宏观和微观水平来评价组织工程支架材料对组织的局部反应，包括早期的炎症反应和随后的纤维结缔组织增生反应。通过体内埋植实验可以直接观察动物机体对材料中的抗原或化学物质产生的免疫应答[38-39]。材料植入机体后[40]被视为异物，在无其他因素影响的情况下，如材料有毒性，会导致其周围组织死亡;如材料无毒性，机体组织对植入物的反应主要是无菌性炎症反应和纤维结缔组织包膜产生。组织反应在早期呈现异物刺激引起轻中度的无菌性急性炎症反应比如水肿、组织充血和中性粒细胞的浸润等等，两周后转为慢性炎症反应包括巨噬细胞、淋巴细胞和纤维母细胞的增生。机体通过吞噬和酶消化方法消除异物，或者通过纤维囊的包裹隔离材料。材料中任何成分分解产生的小分子都会影响炎症反应的过程。白雪[17]研究发现，其自制的镀金镍铜热籽植入肌肉后，植入后的局部组织无明显的毒性及刺激作用，组织相容性较好。 Fulzele等[41]研究发现甘油酯(GMR)和季戊四醇酯(PMR)植入局部组织无明显的炎症反应。

　　4.2 微核试验

　　微核试验是一种检测材料致畸致突变作用的方法，能够简便、快速地检测样品的短期遗传毒性。间隔24 h给药2次，首次给药后第30小时处死小鼠，常规制片。每只动物计数1 000个嗜多染红细胞，计算微核率。Zhang等[42]研究发现，其制备的热敏磁性复合纳米粒通过检测各组嗜多染红细胞中的微核(MN)出现率，未发现复合纳米粒组与阴性对照组间有显著性差异，认为该复合纳米粒无致畸或致突变作用。

　　4.3 肝脏穿刺试验

　　肝脏穿刺试验是将磁性材料置入组织器官一段时间后，观察材料对创伤性组织炎症防御性反应和主要代谢器官、血液系统的功能影响的一种方法。方法: 在无菌条件下，用3%戊巴比妥钠麻醉后在超声导向定位下肝脏穿刺注入0.9%生理盐水和纳米粒悬液，1个月后处死，取心、肝、脾、肺、肾等进行病理形态观察.实验前后试验动物静脉采血作血常规及肝肾功能检查。丛小明等[18]研究发现，沿穿刺方向切开肝脏，见黑色材料浸润在注射路径周围，材料和周围肝组织边界清晰，无瘀血及炎症改变，在材料分布区，部分材料微粒被肝细胞吞噬，肝小叶结构完整无变形以及纤维化，心肝脾肺肾脑等脏器未见明显组织形态学变化。血常规、肝肾功能无明显变化，证明其自制的纳米材料具有良好的组织相容性，适宜应用于肝内局部注射治疗肿瘤。

　　5 生物相容性评价工作中存在的问题

　　近年来，多种纳米磁性材料的生物相容性接受了不同程度的评价研究，有了更多新的试验方法和检测指标，使生物相容性研究不断深入。但是，其中仍然存在一定的问题，首先是存在纯度的问题,目前进行实验的材料往往混有其他杂质, 在使用高纯材料进行实验之前,这些杂质所起到的作用是无法排除的。其次,存在粒度均匀性问题,目前进行实验的材料,粒度分布很宽,从几个纳米到几百纳米的颗粒都存在,不同粒径的性质无法检验出来,目前的实验结果到底是小颗粒作用的结果,还是大颗粒的结果,有待于粒径均匀颗粒实验结果的证明[43]。再次，很多研究[44-47]报道纳米颗粒在介质(如水、细胞培养液)中会发生团聚的现象，发生团聚后，纳米颗粒的物理化学性质可能会发生改变，从而影响其生物学效应。纳米颗粒在细胞培养液中的溶解度对其细胞生物学效应的影响，也是需要特殊考虑的[48-49]。最后,目前所有的评价,都没有一个统一的标准的方法,不同方法之间的结果不具有可比性。这些都需要科研工作者在以后的实验中不断深入探索和研究。

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