瘤内缓释治疗对B16黑色素瘤小鼠影响的实验研究

　　作者：卜洁琼 作者单位：山东大学医学院免疫研究所, 济南 250012

　　【摘要】 探讨肿瘤内缓释治疗对B16黑色素瘤的影响及其机制。方法 将皮下接种B16肿瘤细胞后的成瘤小鼠随机分成4组进行治疗：①生理盐水(NS)对照组，瘤内注射NS;②阿糖胞苷(AraC)对照组，瘤内注射AraC;③单纯缓释治疗组，瘤内注射AraC+缓释液;④免疫缓释液治疗组，瘤内注射AraC+缓释液+二硝基苯 (DNP)。4?d后重复治疗，观察各组小鼠肿瘤的生长情况。两次治疗后1周分离瘤体，HE及网状纤维、弹力纤维、胶原纤维染色，观察瘤体病理改变，用流式细胞术检测脾内CD4+T细胞、CD8+T细胞浸润情况。结果 缓释治疗能够控制肿瘤的生长;HE染色显示，两缓释治疗组瘤内出现大片坏死区域，纤维特殊染色显示，两缓释治疗组三种纤维含量均明显增加(P<0.01);流式细胞术检测表明，缓释治疗组的CD4+T细胞数量明显增多(P<0.05)，但CD4+/CD8+T比值无明显变化。结论 瘤内缓释治疗通过直接破坏肿瘤细胞及增加肿瘤抗原性，从而发挥明显的抗肿瘤作用，为肿瘤治疗提供了新的思路。

　　【关键词】 黑色素瘤 缓释治疗 肿瘤内化疗 二硝基苯酚 抗原修饰

　　BU Jieqiong1, YU Baofa2

　　(1. Institute of Immunology, School of Medicine, Shandong University,

　　Jinan 250012， China;

　　2. Jinan Baofa Cancer Hospital, Jinan 250012， China)

　　Abstract: Objective To explore the effects and mechanism of slow intratumor release of drugs on B16 melonoma in mice. Methods Tumorbearing mice were randomly divided into four groups: the normal saline group, the AraC group, the AraC plus releasing drugs group and the AraC plus releasing drugs and DNP group. Four days later, mice were treated again and the gross tumor volume was determined. Then 1 week later, the contents of three fibers were detected in the interstitial substances of the tumor and the infiltrations of T cells were determined in the splenic organs. Results HE staining results showed that there was a large part of stenosis in the tumor, the fibers in the matrix of tumor were significantly increased and the CD4+T cells were also significantly increased in the two slowrelease groups. Conclusion Slowrelease of drugs into the tumor is one of the effective managements for directly inhibiting tumor growth and preventing micrometastasis.

　　Key words: Melanoma; Slowrelease drug therapy; Intratumoral chemotherapy; Dinitrophenyl; Modified antigen 化疗为肿瘤治疗的常规方法之一，影响化疗效果的关键因素是药物在肿瘤内的浓度和作用时间。常规的静脉给药难以解决此问题，为此众多学者对肿瘤内化疗方法作了大量的基础和临床研究，但至今未能形成统一的瘤内化疗方案[1,2]。1994年于保法曾提出利用肿瘤组织作为药物载体形成药物缓释库的新概念并进行了有效的动物实验[3,4]。本研究进一步探讨了化疗药物在肿瘤内的缓释治疗，以期提高药物在肿瘤部位的作用强度，从而达到更加有效治疗肿瘤的目的。

　　免疫佐剂对辅助抗原诱导机体产生持久的免疫应答十分重要，对于诱导弱免疫原性肿瘤的特异性免疫应答更加重要[5]。而单纯用灭活的肿瘤细胞或将其破碎后用作瘤苗，由于肿瘤的免疫原性太低，通常也不足以诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫保护力。有文献报道[6],用半抗原二硝基苯(DNP)修饰的肿瘤疫苗在黑色素瘤的治疗中取得了很好的疗效。本研究结合以上实验设计了针对肿瘤的瘤内缓释治疗方案，并在动物实验中取得了肯定的疗效，具体报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞与动物 B16为C57BL/6小鼠来源的黑色素瘤细胞株，购自中国科学院细胞库，由本实验室保种传代。实验动物C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物中心，雌雄各半，周龄6 8周，体重18 22?g，无菌环境中饲养。

　　1.2 主要试剂 缓释液为本实验室临时配制;阿糖胞苷系上海华联制药厂产品，批号06030704，临用前用适宜溶剂配制;二硝基苯系上海五连化工厂产品;RPMI1640培养基系Gibco公司产品;小牛血清系杭州四季青公司产品;纤维染色试剂盒系福州迈新生物公司产品;PECy5荧光标记CD4、CD8a抗体购自Ebioscience公司。

　　1.3 瘤细胞的培养 B16黑色素瘤细胞用RPM I1640 (含10%小牛血清)培养基，37?℃，5% CO2的恒温环境中培养，约2 4?d传代。收集对数生长期的B16黑色素瘤细胞，调整到浓度为2×106/mL用于动物实验。

　　1.4 荷瘤鼠的建立及缓释药物治疗 将制备好的肿瘤细胞悬液0.2?mL于无菌条件下皮下注射接种于小鼠左前肢腋下，一般在接种后5 6?d按肿瘤体积随机分组进行初次治疗，依次为①NS对照组，瘤内注射生理盐水;②AraC对照组，瘤内注射AraC;③单纯缓释治疗组，瘤内注射AraC+缓释液;④免疫缓释液治疗组，瘤内注射AraC+缓释液+DNP。4?d后进行重复治疗，观察各组小鼠肿瘤的生长情况。治疗7?d后脱颈椎处死实验动物，无菌取肿瘤组织和脾脏进行后续实验。测量肿瘤长(A)和宽(B)，然后将肿瘤视为近似球形，计算瘤体积:肿瘤体积=A×B2/2。

　　1.5 肿瘤标本HE染色和纤维染色标记 肿瘤组织经4%的多聚甲醛溶液固定，按常规制成4?μm石蜡切片，裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上(4张)，60?℃烘片2?h后，1张切片行HE染色，另3张按纤维染色试剂盒说明书，分别行网状纤维、弹力纤维、胶原纤维标记染色。脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察病理学改变。肿瘤坏死程度和范围的确定：切取移植瘤鼠肿瘤组织置于10%福尔马林液中固定，每份标本于近中心取3处作病理切片，HE染色，在光镜下观察肿瘤组织坏死情况，我们根据肿瘤坏死范围不同分成轻度(30%以下)，中度(30% 60%)，重度(60%以上)三级。普通光学显微镜下胶原纤维染色后呈蓝色，网状纤维呈黑色，弹力纤维呈深紫色。各组选取8 10张染色切片，每张切片随机选取4个视野，采用图文分析系统对染色纤维在多个视野下所占面积比的平均值进行计算，对各种纤维含量进行半定量观察。

　　1.6 流式细胞术(FCM) 处死小鼠后，取出脾脏制备脾细胞悬液，用含5%FCS的PBS洗细胞2次(1?500?r/min离心6?min)，计数，调细胞数量为107/mL。各管细胞中分别加入PECy5 荧光标记的抗CD4、CD8a荧光染色液(荧光抗体按说明稀释)，轻轻混匀后避光放置于4?℃ 30?min。用PBS液洗去未结合的荧光抗体，洗2次(1?500?r/min ，离心6?min)。用流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞的数量。

　　1.7 统计学处理 全部数据采用SPSS 11.0软件进行统计分析。实验数据均以±s表示，对各项计量资料进行t检验分析。

　　2 结 果

　　2.1 缓释治疗对小鼠肿瘤生长的影响 抑瘤实验结果表明，与生理盐水对照组相比，AraC对照组对肿瘤的增长无明显的抑制作用;与AraC对照组相比，两组缓释治疗均对肿瘤的增长有明显的抑制作用,提示缓释治疗可以抑制小鼠的肿瘤生长。同时在缓释治疗的两组中，免疫缓释治疗组对肿瘤生长的抑制更加明显，见图1。由肿瘤生长曲线可见，各组的肿瘤生长曲线斜率都有明显的差别。随时间进展，生理盐水对照组肿瘤体积增长速度明显高于其他组别，而免疫缓释治疗组，肿瘤体积增长在第二次治疗后出现平台期,肿瘤增殖相对停滞。

　　2.2 肿瘤组织病理改变 光学镜下观察发现，对照组瘤细胞排列密集成片,坏死区较少，瘤体内血管丰富，肿瘤组织生长旺盛。单纯缓释组及免疫缓释组的瘤细胞区域则出现大片坏死，瘤细胞溶解以及细胞核固缩，瘤旁组织和瘤体内散在少量淋巴细胞,切片染色较对照组浅。肿瘤坏死程度见表1。其中生理盐水对照组坏死较少;AraC组以轻、中度坏死为主，部分见到小片状瘤细胞变性;缓释两组以中重度坏死为主，可见大小不一的多个坏死灶。

　　生理盐水组AraC组单纯缓释组免疫缓释组轻度66.750.010.010.0中度33.337.560.060.0重度-12.530.030.0

　　2.3 肿瘤组织纤维染色 切片特殊染色显示，与两对照组相比，两治疗组的肿瘤组织中弹性纤维明显较粗，连续分布于肿瘤组织内及瘤旁组织，着色深;胶原纤维明显增多，排列紊乱，出现分支且互相交织，呈连续分布，着色深;瘤组织中网状纤维明显增多、增粗，有大的分支并交织成网状,着色深。利用图像分析各组三种纤维的含量，见表2。

　　*2.4 流式细胞术分析脾脏内T细胞数量 FCM检测结果显示，与生理盐水对照组相比，AraC组脾脏CD4+T淋巴细胞数量明显增高(P<0.05)，两缓释治疗组也有统计学意义(P<0.01)，提示缓释治疗可在一定程度上改善细胞免疫功能。与AraC组相比，单纯缓释治疗组脾脏CD4+T淋巴细胞数量无统计学意义(P>0.05)，而免疫缓释治疗组与之存在统计学意义(P<0.05)，但两缓释治疗组之间无统计学意义(P>0.05)。各实验组CD4+/CD8+的比值之间无统计学意义(P>0.05)，见表3。

　　*3 讨 论

　　开展肿瘤内化疗,可使药物在肿瘤内浓度暂时升高，同时药物缓释技术的发展也为提高肿瘤内化疗的疗效开辟了新的思路[7,8]。本研究主要探讨了接种动物经过肿瘤内缓释治疗后在体内诱导的相关病理及细胞免疫反应。

　　B16细胞是来源于C57BL/6小鼠的黑色素瘤细胞，在同系小鼠可以形成移植瘤。本研究的结果显示，给B16荷瘤鼠瘤内注射缓释药物后，肿瘤体积明显小于对照组。从肿瘤生长曲线中可见缓释组对肿瘤生长有明显的抑制趋势，提示化疗药物联合缓释剂及DNP可以明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长。显微镜下同样可见,治疗组瘤组织中存在大片变性坏死区域，与对照组差异明显，提示缓释疗法可引起肿瘤细胞的坏死。

　　肿瘤的间质主要是由血管和结缔组织构成的网架，对肿瘤细胞起着重要的支持营养作用。间质中产生的各种纤维，能在一定程度上阻遏肿瘤细胞的生长和侵袭。本研究结果显示，治疗组的纤维增生明显多于对照组，并在瘤组织周围形成包绕，这种纤维增生和包绕可控制肿瘤的生长，并且可能延缓瘤细胞的浸润过程，限制瘤细胞的活动以及遏制其侵入血管，从而能够减少肿瘤的播散机会。

　　有文献报道[9]，当化疗引起肿瘤细胞死亡时，释放的肿瘤抗原可经抗原递呈途径诱导有效的免疫应答反应。从流式细胞仪检测结果可见，缓释治疗组中荷瘤鼠的抗肿瘤免疫应答较两对照组增强，提示缓释液不仅直接杀死肿瘤细胞，而且死亡的肿瘤细胞可诱发机体的免疫功能。DNP则可能通过增强肿瘤的抗原性激发了小鼠体内的细胞免疫，从而提高机体的特异性抗肿瘤免疫应答。有文献提出[10]，DNP修饰可以诱导机体产生针对原发肿瘤有杀伤活性的特异性T淋巴细胞，我们的结果支持这一观点。

　　瘤内直接注射可提高治疗药物的作用强度，并且能够减少机体的副反应，是一种较方便可行的方法。本研究所应用的缓释剂可直接杀死肿瘤细胞增加肿瘤抗原，并运用半抗原DNP修饰提高了肿瘤细胞的免疫原性，有效地诱导或激活机体肿瘤免疫反应。肿瘤内缓释治疗有可能阻止和延缓肿瘤的生长及转移复发，是一种有效的肿瘤治疗方法，它将为肿瘤免疫治疗提供新的思路。

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