非霍奇金淋巴瘤中p53基因突变情况研究

　　作者：罗春英，邓飞 作者单位：(右江民族医学院病理学教研室，广西 百色 533000;遵义医学院附属医院病理科，贵州 遵义 563003)

　　【摘要】 目的 探讨非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin′s Lymphoma，NHL)中p53基因第5～8外显子突变情况。方法 采用PCR-SSCP法对47例NHL进行p53基因第5～8外显子的点突变研究。结果 p53基因第5～8外显子总突变率为48.94%(23/47)。其中第6外显子的突变率最高为17.02%，其次为第8外显子，突变率为12.87%;高度恶性组和低度恶性组突变率分别为50.00%(12/24)、34.78%(8/23)(P>0.05);T细胞和B细胞突变率分别为39.29%(11/28)、47.37%(9/19)(P>0.05)。结论 NHL中存在较高p53基因突变率，提示其突变可能参与了NHL的发生发展。高度恶性组p53基因突变倾向于高发。

　　【关键词】 非霍奇金淋巴瘤;基因，p53;突变

　　p53 gene mutation in Non-Hodgkin’s Lymphoma

　　Luo Chun-ying，DENG Fei

　　(Deparment of Pathology，Youjiang Medical College for Nationalities，Baise，Guangxi 533000，P.R.China;Department of Pathology，Affiliated Hospital of Zhunyi Medical College，Zhunyi，Guizhou 563003，P.R.China)

　　Abstract: Objective To investigate the role of p53 gene mutation (exons 5～8)in Non-Hodgkin’s Lymphoma(NHL). Methods A PCR-SSCP method was used to detect the frequence of p53 point mutation in exons 5 to 8 in 47 patients with NHL. Results Mutation rate of p53 exons 5～8 was 48.94%(23/47).Exon 6 was found with the highest mutation rate of 17.02%，exon 8 with the second rate of 12.87%.The mutation rate in high grade group and low grade group was 50.00% (12/24) and 34.78%(8/23)，respectively (P>0.05);the mutation rate in T-cell and B-cell derived cases was 39.29%(11/28) and 47.37% (9/19)，respectively (P>0.05). Conclusion High mutation rate of p53 gene is present in NHL，which indicates that p53 gene mutation might play a role in pathogenesis and progression of NHL.

　　Key words: Non-Hodgkin’s Lymphoma;genes，p53;mutation

　　非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin′s Lymphoma，NHL)是淋巴造血系统中一种常见的恶性肿瘤，约占所有淋巴瘤的80%～90%[1]。我国NHL约占恶性肿瘤的3%～4%，为恶性肿瘤第8位[2]。p53基因是目前发现与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因[3]，在细胞修复、生长与凋亡的调控中起着重要的作用。NHL的发生和发展过程中涉及染色体易位、体细胞突变、基因扩增和基因缺失等多步遗传学改变。在不同阶段这些改变可引起癌基因的激活和抑癌基因的失活。故在NHL中深入研究p53基因是有必要的。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本 标本取自1998～2003年遵义医学院附属医院及贵州省人民医院病理科的各型NHL存档材料47例，所有病例均根据2001年WHO[4]淋巴造血组织肿瘤分类，形态学及免疫组织化学切片复习确诊。其中T细胞性肿瘤28例，B细胞性肿瘤19例。取反应性增生性淋巴结组织作为对照。标本均用4%甲醛固定、石蜡包埋。

　　1.2 石蜡组织DNA提取 提取DNA主要试剂购于上海生工生物技术有限公司。组织块大且坏死少者常规脱蜡后采用常规蛋白酶K消化，酚—氯仿—异戊醇抽提，盐沉淀法提取石蜡组织DNA，反之用粗提法：常规脱蜡后加入裂解液和蛋白酶K，55℃过夜，待组织溶解后灭活蛋白酶K，吸上清液做PCR模板。核酸测定仪上测定DNA浓度及比值A260/A280，比值<1.6者弃用重提。

　　1.3 p53基因突变分析

　　1.3.1 引物 p53第5～8外显子DNA引物序列由上海生物工程技术有限公司合成。引物序列，见表1。

　　表1 p53基因5～8外显子引物序列及所扩增的DNA的长度(略)

　　注，P1：指正向;P2：指反向

　　1.3.2 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR扩增相关试剂：Taq酶(B0089)、dNTP(D0056)、10×PCR Buffer、MgCl2(0403)购于上海生工生物技术有限公司。PCR反应体系为50μl，其中10×Buffer 5μl、1.5mmol/L MgCl2、200μmol/L dNTPs、0.5μmol/L引物一对、0.2U Taq酶、0.5μg模板DNA。以超纯水补足体积。反应条件：95℃预变性5min，于4min时加Taq酶，94℃变性1min，退火1min，5～8 外显子的退火温度分别是58℃、62℃、60℃、60℃，72℃延伸1min，循环35次，最后一个循环延伸7min，4℃保存备用。以双蒸水代替模板做空白对照。

　　1.3.3 10%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，硝酸银染色。

　　1.3.4 图像分析 采用全自动凝胶成像分析系统，利用Genesnap软件获取图像，Genetools软件(版本3.0)分析凝胶成像。SSCP分析：如出现目的DNA条带泳动变位，即条带增加、减少或移位(待测DNA片段与正常DNA片段电泳距离差>3mm则判定链的迁移率有改变)，则判断为有突变。

　　1.3.5 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件进行分析。两组间比较采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 p53基因突变情况 47例NHL中有23例标本的p53基因组DNA存在异常迁移率带(见图1、2)，表明这些肿瘤可能存在p53基因突变。

　　图1 p53exon7(114bp) PCR扩增产物琼脂糖电泳图(略)

　　M：Marker Track1：空白对照 Track2-9：标本扩增样品

　　图2 p53 exon7 PCR-SSCP图箭头示肿瘤组织突变。注：肿瘤组织较淋巴结反应性增生组织电泳条带减少，定为突变。 C：淋巴结反应性增生，T：肿瘤组织(略)

　　2.2 不同分型NHL中p53突变率 总突变率为48.94%(23/47)，T细胞组和B细胞组突变率以及高度恶性组和低度恶性组突变率差异无显著性(P>0.05)，见表2。

　　表2 p53外显子在淋巴瘤组织中的突变分布(略)

　　注：与高度恶性组比较，a：χ2=1.11，P>0.05;与B细胞组比较，b：χ2=0.30，P>0.05

　　2.3 p53第5～8外显子突变率 各外显子的突变率间差异无显著性(P>0.05)，见表3。

　　表3 p53各外显子在47例淋巴瘤组织中的突变率(略)

　　注：各组间比较，χ2=1.73，P>0.05

　　3 讨论

　　肿瘤的发生至少涉及癌基因、抑癌基因和错配修复基因的异常。p53基因被认为是肿瘤抑制基因家族的重要成员之一，p53基因失活常引起肿瘤细胞的增殖与恶性转化，与肿瘤的发生和演变有十分密切的关系。p53基因位于17P13.1，由11个外显子和10个内含子组成，全长20KB。其核心作用是介导DNA损伤后的细胞反应，维持遗传稳定性。其编码的p53蛋白能与特异的DNA序列结合，上调P21WAPI的表达从而抑制cyclin-Cdk复合物的磷酸化活性，使细胞生长阻滞在G1期以修复损伤的DNA。p53蛋白还能激活BAX基因，诱导细胞凋亡。p53基因的缺失或突变使带有损伤的DNA的细胞未能在G1期修复而活着进入S期，促进肿瘤的发生。同时突变型p53具有癌基因的作用，促进细胞的恶性转化。在恶性血液病中的研究表明[5]，p53基因的变化与预后不好的急性髓系白血病、B细胞系的急性淋巴细胞白血病以及高度恶性的NHL有关。本研究采用PCR-SSCP法分析了47例NHL p53基因第5～8外显子突变，总突变率为48.94%，其中外显子6的突变率最高为17.02%，其次为外显子8，突变率为12.87%;高度恶性组和低度恶性组突变率分别为50.00%(12/24)、34.78%(8/23)(P>0.05);T细胞和B细胞性NHL突变率分别为39.29%(11/28)、47.37%(9/19)(P>0.05)。本研究结果表明在NHL中，尤其在恶性程度较高的NHL中存在p53基因突变，且突变在T细胞性和B细胞性NHL中差异无显著性，p53基因突变在NHL的发展演变中可能起重要作用，有助于恶性程度和预后的判断。为了全面了解p53基因在NHL中的情况，有必要在其它外显子上作进一步的工作，因为虽然肿瘤中p53基因突变热点位于外显子5～8，但仍有可能是位于其他外显子上，也许这种情况在NHL中是比较常见的。全面了解p53基因在NHL中的突变情况也为后续研究p53基因突变与微卫星不稳定性的关系打下基础，以更好地阐明NHL的发病机制。

　　【参考文献】

　　[1] 李甘地.病理学[M].北京：人民卫生出版社，2001.275.

　　[2] Hodges KB，Vnencak-Jones，CL，Larson RS，et al.Rarity of genomic instability in pathogenesis of systemic anaplastic large cell lymphoma (ALCL) in immunocompetent patients [J].Hum Pathol，1999，30(2):173-177.

　　[3] Werness BA，Wang HQ，Chance J，et al.p53-independent expression of p21waf1/cip1 in preinvasive and invasive squamous neoplasms of the uterine cervix [J].Mod Pathol，1997，10(6):578-584.

　　[4] Jaffe ES，Harris NL，Stein H，et al.Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues.Vol.3 of World Health organization classification of tumours [M].Lyon France: IARC Press，2001.

　　[5] Prokocimer M，Rotter V.Structure and founction of p53 in normal cells and their aberrations in cancer cells:projection on the hematologic cell lineages [J].Blood，1994，84(8):2391-2411.