淋巴道转移舌鳞癌细胞RECK、MMP-2和MMP-9表达的动物实验研究

　　作者：姚金光，李龙江，邝晓聪，温冠媚，李祖云，李俊 作者单位：右江民族医学院口腔科学教研室，广西 百色 533000

　　【摘要】 目的 在动物模型水平探讨RECK表达水平与MMP-2 和 MMP-9的关系。方法 采用爪垫注射Tca8113细胞建立舌鳞癌淋巴道转移裸鼠模型，收集4周后回流淋巴结，采用免疫组化、Western blot方法检测RECK、MMP-2、MMP-9水平。结果 8例舌癌淋巴结转移模型裸鼠均有MMP-2、9表达，细胞染色呈较强的阳性，而RECK未发现较强阳性细胞出现，只有可疑的阳性细胞散在出现;淋巴结转移的舌癌细胞RECK表达明显低于用于移植的Tca8113舌癌细胞(t=7.78，P<0.01);MMP-2、9表达水平均显著高于用于移植的舌癌细胞(t分别为3.06，2.25，P<0.01或0.05)。结论 动物体内实验进一步证实RECK低水平表达可增加舌癌侵袭转移机率，其调控机理可能与RECK抑制MMP-2、9表达有关。

　　【关键词】 舌;癌，鳞状细胞;RECK;基质金属蛋白酶;肿瘤转移;淋巴;模型，动物;小鼠

　　An animal-based experiment on RECK，MMP-2 and MMP-9 expression in lymphatic metastatic tongue carcinoma cells

　　YAO Jin-guang，LI Long-jiang，KUANG Xiao-cong，WEN Guan-mei，LI Zu-yun，LI Jun

　　(Department of Stomatology，Youjiang Medical College for Nationalities，Baise，Guangxi 533000，China;Department of Oral and Maxillofacial Surgery，West China College of Stomatology，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610041，China; Department of Pathophysiology，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi 530021，China; Department of Pathology，Guangxi Medical

　　University，Nanning，Guangxi 530021，China)

　　Abstract： Objective To approach the relationship between the expressive level of the reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK) and matrix metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9) by nude mice model-based experiment. Methods The tongue carcinoma lymphatic metastasis model of the nude mouse was established by injecting Tca 8113 cells into the nail pad.We collected the regurgitant lymph nodes after 4 weeks and detected RECK，MMP-9 and MMP-2 levels by immunohistochemistry and Western blot assay. Results There were 8 nude mice of the tongue carcinoma lymphatic metastasis model expressing MMP-2 and MMP-9，and the cell staining was also strong，while there were not positive staining cells in the RECK detection，and only some scattered suspicious positive cells were found.RECK expressive level of lymphatic metastatic tongue carcinoma cell decreased significantly and were lower than the level in transplanted Tca 8113 cells (t=7.78，P<0.01); while the expressive levels of MMP-2 and MMP-9 were both higher than those of the control group (t=3.06 and 2.25，respectively，P<0.01 or 0.05). Conclusion The animal in vivo experiments confirmed that low expression of RECK could enhance invasiveness and metastasis of tongue carcinoma，the regulating mechanism may be related to RECK inhibiting MMP-2 and MMP-9 expression.

　　Key words： tongue; carcinoma，squamous cell; the reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK); matrix metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9); neoplasm metastasis; lymph; models，animal; mice

　　舌鳞癌淋巴道转移是口腔恶性肿瘤的研究热点之一，与临床预后密切相关，其中基质金属蛋白酶家族(MMPs)在舌鳞癌侵袭、转移中扮演重要角色。初步的细胞学和临床研究表明[1]，RECK基因可以通过抑制MMP-2、9的活性，阻碍、抑制癌细胞转移，构成影响癌细胞转移的调控体系。本研究利用舌鳞癌淋巴道转移动物模型，旨在通过动物实验进一步证实RECK基因与MMPs的相互关系，并从中探讨舌癌淋巴道转移的生物学特点。

　　1 材料与方法

　　1.1 舌鳞癌淋巴道转移动物模型的建立 参考爪垫注射癌细胞建立鼻咽癌淋巴道转移模型方法[2]，用爪垫注射Tca8113细胞建立舌鳞癌淋巴结转移裸鼠模型，具体操作如下：取经处理的1×107个/ml Tca 8113细胞悬液，选择裸鼠四肢的爪垫内侧4个点进行皮下注射，总体积为0.5ml，观察动物模型的一般情况，4周之后取回流淋巴结(腹股沟、腋下等部位)检测相关基因的表达水平。

　　1.2 实验分组、取材

　　1.2.1 实验分组 (1)转移舌鳞癌细胞组：选用裸鼠11只进行淋巴道转移动物模型的建模，动物成模与入选标准：①肉眼观发现回流区域淋巴结肿大，或者H-E染色确诊或MMP-2、9染色阳性;②动物模型的淋巴结二代舌癌细胞悬液分离、纯化培养发现舌癌细胞。(2)舌鳞癌Tca8113细胞对照组：用于与转移的舌鳞癌细胞作对照。(3)正常裸小鼠对照组：取淋巴结做对照，5只。

　　1.2.2 实验取材与样品制备 转移舌鳞癌细胞组(成功建模后)与正常裸鼠对照组，在小鼠四肢的爪垫注射美蓝，对四肢和腹腔的淋巴回流区域淋巴结显色，并进行取材。取下的淋巴结做两种处理，一是多聚甲醛固定，用于H-E染色及免疫组化染色，二是制备淋巴结细胞悬液，采用肿瘤细胞分离液进行肿瘤细胞的初步分离，制成1×106个/ml浓度细胞悬液，用于Western blot检测。舌鳞癌Tca 8113细胞对照组，消化培养细胞，制成1×106个/ml浓度细胞悬液，用于Western blot检测。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 H-E检测 检测标本为转移舌鳞癌细胞组与正常裸鼠对照组的淋巴结组织切片。

　　1.3.2 免疫组化检测 RECK，MMP-2，MMP-9采用小鼠抗人RECK单抗(美国R &D公司)，按1∶200比例用单抗专用稀释液稀释，二抗检测采用广泛通用型超敏试剂盒，显色系统采用DAB系统，分别为麦新公司与Gibco BRL公司产品。操作严格按试剂盒流程。检测标本为转移舌鳞癌细胞组与正常裸小鼠对照组的淋巴结组织切片。

　　1.3.3 Western blot检测 抗人MMP-9单抗、MMP-2单抗(晶美公司)，RECK小鼠抗人单抗(美国R &D公司)，HRP标记羊抗鼠二抗与免疫印迹发光底物(Pierce公司)，显影底片(柯达公司)，检测淋巴道转移舌鳞癌细胞与体外培养舌鳞癌细胞。

　　1.4 统计学处理 计量数据以x±s表示，采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 舌癌淋巴结转移模型的一般情况与H-E检测情况 舌鳞癌淋巴道转移动物模型的裸鼠的活动、精神状态、进食等情况比正常裸鼠稍差，在淋巴回流的腹股沟、腋下等区域，4周后转移的淋巴结为绿豆或黄豆大小，质地偏硬，有粘连感，活动度尚可，转移发生率为72.72%(8/11)。取肿大淋巴结，H-E染色后在光镜下发现：转移的癌细胞多积聚在淋巴结的髓窦区域，其它区域也有散在分布，生长方式以灶性或散在细胞存在，转移细胞形态异型性较大，染色质较深，有较丰富的胞浆，而正常裸鼠对照组无舌鳞癌细胞，见图1。

　　2.2 免疫组化检测转移模型中淋巴结转移癌细胞RECK、MMP-2、9表达情况 8例舌癌淋巴结转移模型裸鼠均有MMP-2、9表达，细胞染色呈较强的阳性，细胞分布呈散在或灶性分布，主要也是聚集于淋巴结的髓窦区域，而RECK未发现较强阳性细胞出现，只有可疑的阳性细胞散在出现，而正常裸鼠对照组均无MMP-2、9与RECK阳性表达细胞，见图2～图4。

　　图1 舌癌转移模型 裸鼠淋巴结，H-E染色(略)

　　图2 舌癌转移模型裸鼠淋 巴结中MMP-2表达情况(略)

　　图3 舌癌转移模型裸鼠淋 巴结中MMP-9表达情况(略)

　　图4 舌癌转移模型裸鼠淋 巴结中RECK表达情况(略)

　　2.3 淋巴结转移模型中舌癌细胞RECK、MMP-2、9表达情况 在舌癌淋巴结转移模型中取淋巴结并分离转移癌细胞，进行RECK、MMP-2、9水平表达的Western blot检测，发现淋巴结转移的舌癌细胞RECK表达明显低于用于移植的Tca 8113舌癌细胞(P<0.01);而MMP-2、9水平表达显著高于用于移植的舌癌细胞(P<0.01或0.05)，见表1。

　　表1 淋巴结中转移舌癌细胞RECK、MMP-2、9水平表达(略)

　　3 讨论

　　舌鳞癌是发病率最高的口腔恶性肿瘤，早期即可发生颈淋巴结转移，临床观察发现其淋巴结转移率高达40%～50%，而且与预后密切相关，是舌鳞癌患者复发、死亡的重要原因。因此，有必要对淋巴道转移的舌鳞癌细胞的生物学特征作深入研究。诸多研究表明[2]，移植进入动物体内的肿瘤细胞，存活不足1%，不足0.1%形成转移灶，但由于癌细胞具有非常惊人的对数分裂增殖能力，“幸存”的转移癌细胞增殖分裂成为灶性结构并非难事，因此，“幸存”转移癌细胞的生物学特性就与转移密切相关。

　　针对淋巴道转移的动物模型中的舌鳞癌细胞，本研究进行不同层次的实验研究，首先对动物模型的淋巴结进行常规的H-E染色，观察发现有明显的转移灶，提示有一定数量的舌鳞癌已经侵入淋巴结，但主要聚集于淋巴结的髓窦区域，而舌鳞癌细胞灶性的生长方式，提示转移的细胞已经开始增殖分裂，在淋巴系统开始其侵袭的生物学行为。其次，对有转移灶的淋巴结进行免疫组化染色，与对照的正常裸小鼠淋巴结相比，MMP-2、9的免疫组化染色，发现有染色呈较强阳性的细胞，细胞呈散在或灶性分布，也主要分布于淋巴结的髓窦区域，提示此类人的舌鳞癌细胞有较强的侵袭性，而RECK未发现较强阳性细胞出现，只有可疑的阳性细胞散在出现;最后，收集所有淋巴结并制备细胞悬液，分离其中的肿瘤细胞进行RECK、MMP-2、9水平表达的Western blot分析，发现淋巴结转移的舌癌细胞RECK表达显著低于用于移植的Tca 8113舌癌细胞，而且MMP-2、9水平表达均显著高于用于移植的Tca 8113舌癌细胞的水平，提示舌癌淋巴结转移模型淋巴结中的舌癌细胞具有强大的侵袭性，Tca 8113舌癌细胞中有一群RECK基因低表达而MMP-2、9水平高表达的癌细胞，侵袭能力很强，从动物模型的在体研究角度，阐述了淋巴道转移的动物模型中的舌鳞癌细胞重要的生物学特点。

　　综合体外的细胞学研究结果表明[3，4]，RECK基因能在转录后抑制至少三种MMPs的表达，如：MMP-2、MMP-9、MT1-MMP(MMP-14)。膜锚定的RECK可以抑制pro-MMP-9(MMP-9的前体形式)的分泌，而膜锚定的RECK与可溶RECK联合作用，既可以抑制MMP-9，也可以抑制MMP-2、MMP-14的活性，其中主要相互作用的形式是蛋白水平的相互调节。从RECK基因对MMPs的调节效果来看，其生物学功能与基质金属蛋白酶抑制剂TIMP有相似之处，主要不同点在于RECK是膜锚定的而TIMP是分泌型的，根据作用特点，可以推测RECK是在细胞表面附近区域发挥作用，TIMP则能在较远距离发挥作用[5，6]。

　　因此，一旦注射移植，经过动物模型的筛选，其中有较强转移能力与转移活性的细胞到达淋巴结并增殖形成微转移灶，至少说明在功能方面淋巴结转移灶的细胞在侵袭特性上是非常强的，可以解释动物模型转移淋巴结中MMP-2、9水平高表达的现象。根据上述RECK与MMPs的关系分析，可以推测MMP-2、9分泌水平的升高与RECK基因表达下降有关。此外，在淋巴结中舌癌细胞的RECK与MMP-2、9表达水平的检测，由于例数偏少，不宜做RECK与MMP-2、9表达水平的相关分析。但由于动物模型具有重复性好的优点，仍可以推测转移舌癌细胞RECK表达水平低，对MMP-2、9表达水平抑制就减弱，从而促进舌癌细胞的转移，这是动物实验水平的重要实验依据。

　　【参考文献】

　　[1] Kazumasa Takenaka，Shinya Ishikawa，Yozo Kawano，et al.Expression of a novel matriz metalloproteinase regulator，RECK and its significance in resected non-small cell lung cancer [J].European Journal of cancer，2004，40：1617-1623.

　　[2] 高进，章静波.癌细胞转移模型的建立与应用[M].北京：科学出版社，2003：74-78.

　　[3] Oh J，Takahashi R，Kondo S，et al，The membrane-anchored MMP inhibitor RECK is a key regulator of extracellular matrix integrity and angiogenesis [J].Cell，2001，107(6)：789-800.

　　[4] Sasahara RM，Takahashi C，Noda M.Involvement of the Sp1 site in ras-mediated down regulation of the RECK metastasis suppressor gene [J].Bioche Biophys Res Commun，1999，264(3)：668-675.

　　[5] Welm B，Mott J，Werb Z.Developmental biology： vasculogenesis is a wreck without RECK [J].Curr Biol，2002，12(6)：209-211.

　　[6] Noda M，OH J，Takahashi R，et al.RECK： a novel suppressor of malignancy linking oncogenic signaling to extracellular matrix remodeling [J].Cancer Metastasis Rev，2003，(3)：167-175.