HIF-1α和E-cad与恶性肿瘤

　　作者：王 庭 作者单位：九江学院医学院病理学教研室 江西九江 332000

　　【关键词】 恶性肿瘤 缺氧诱导因子 上皮性钙黏附蛋白

　　肿瘤的发生、发展与细胞的过度增殖和凋亡的减少有关，肿瘤细胞无限制的增殖是其主要的特征，而细胞增殖需要大量耗氧，研究证实缺氧是实质性肿瘤物理微环境的基本特征之一[1]。越来越多的证据表明缺氧是决定恶性肿瘤预后的重要因素，肿瘤的缺氧不仅是发生恶性转化的始动因素，还可以诱导肿瘤细胞对放疗及化疗的耐受性，更重要的是缺氧促进肿瘤细胞的生长、浸润和转移等恶性生物学行为的发生[2]，缺氧导致的一系列基因和蛋白的表达正是这些现象发生的根本原因[3]，而缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)在肿瘤的血管生成和能量代谢中起重要的调控作用。

　　1 HIF-1α的结构和功能

　　HIF-1是介导哺乳动物和人类细胞低氧反应的核转录因子，是1992年Semenza等[4]在研究红细胞生成素(EPO)基因表达时发现的。随后研究表明，HIF-1可以上调细胞存活、生长、分化以及凋亡等基因的表达，尤其在缺氧状态下对氧的平衡起中心作用[5]。1995年Wang[6]等从培养鼠的Hep3B和2HelaS3细胞中提纯了HIF-1，它是由缺氧诱导的、连接在EPO基因缺氧反应元件(hypoxia response element,HRE)上的核因子。HIF-1以异源二聚体的形式存在，由分子质量为120kDa的亚单位HIF-1α和分子质量为91-94kDa的亚单位HIF-1β，α、β亚单位都含有基本的螺旋-套索-螺旋结构域(basic-helix-loop-helixdomain,bHLH)和PAS(Per-ARNT/Abr-Sim)结构域，是负责HIF-1二聚体以及与DNA结合的区域。β亚基为基础表达蛋白;而α亚基为氧调节蛋白，它包括两个转录活性区，N末端活化区(N-TAD)和C-末端活化区(C-TAD)，氧对HIF-1活性的调节主要通过α亚基完成。但HIF-1α在胞质处于失活状态，需与配体结合转位至核内与HIF-1β结合后形成有功能的二聚体，然后进行转录调节[7]。人类HIF-1α基因定位于14号染色体(14q21-24)，其cDNA全长372bp，开放阅读框2748bp，编码826个氨基酸。该分子的氨基端方向依次排列着碱性区域、HLH区和PAS区，共同构成转录因子DNA结合结构区域(DNA-binding domain,DBD)。在低氧环境中，HIF-1α的N端介导异源二聚体的形成以及与DNA的结合，而HIF-1α的C端特定区域介导HIF-1激活，活化的HIF-1在其HRE的转录起始部位形成一个转录起始复合物，启动目标基因的转录。缺氧细胞HIF-1介导转录活性的增加，不仅由于HIF-1α的水平升高，而且HIF-1α转录激活区域的活性也增加。

　　2 HIF-1α在缺氧环境中的表达及其对靶基因的调控

　　HIF-1α受细胞内氧分压的精细调节。机体在正常氧分压下，HIF-1α通过泛素-蛋白水解酶系统迅速降解。HIF-1α蛋白中含有两个氧依性降解域(oxygen-dependent degradation domain,ODDD)，当细胞在有氧环境时，HIF-1α降解的速度很快，其半衰期甚至不到5min，正常氧分压下ODDD介导HIF-1α被迅速泛化并为ubiquitin蛋白酶体降解，特异性阻断ubiquitin蛋白酶体可以在有氧状态下稳定HIF-1α及HIF-1转录复合体。但在缺氧状态下，HIF-1α诱导速度加快，降解受阻，HIF-1α水平迅速升高，4h可以达到最高值，从而得以与HIF-1β结合形成一个完整的HIF-1转录复合体，参与相应靶基因的转录调控[8]。

　　HIF-1α的表达和活性的调节表现在多级水平上，包括其mRNA表达、蛋白表达、核定位及激活[9]。癌基因的激活和抑癌基因的失活可导致瘤细胞中HIF-1α的表达升高和活性的增强。如研究发现体内缺氧诱导凋亡所必需的p53能抑制HIF-1α转录激活，而缺氧诱导p53需要HIF-1α协同作用，HIF-1α能与p53结合并使其稳定。p53功能失活导致HIF-1α表达增加，促进新生血管生长[10]。目前VHL基因在研究HIF-1的调节中最引人关注，与HIF-1α降解密切相关。VHL是与Von Hippel Lindau(VHL)综合征和肾细胞癌有关的抑癌基因，HIF-1α的水解过程需要VHL的β域与HIF-1α的氧依赖的降解结构域结合，并在多种蛋白因子的共同参与下进行。如果肿瘤细胞中缺乏有功能的pVHL将使HIF-1α降解受阻而导致肿瘤中HIF-1α高水平表达，血管形成增多，加速肿瘤发展[11-13]。

　　Wiener等[14]发现人多种器官和组织中的cDNA文库中存在HIF-1α序列，在机体缺氧状态下可以诱导HIF-1的表达增加。在细胞内存在氧感应子，它是一种血红蛋白，氧可不依赖线粒体呼吸链与之直接作用。在HIF-1上游存在一调控子第V因子，当氧浓度降低时，脱氧型氧感应子激活某一信号，此信号被蛋白磷酸化后传递给第V因子，导致HIF-1α表达增加[15]。HIF-1α的靶基因不仅包括编码诱导血管生成的因子，如血管内皮因子;还包括一些编码使各系统之间和细胞之间保持稳定状态的基因如促红素、诱导性一氧化氮合酶、铁传递蛋白、铜蓝蛋白、葡萄糖转移因子、3-磷酸甘油脱氢酶、乳酸脱氢酶、胰岛素样生长因子等。这些基因的蛋白产物涉及血管生成、能量代谢、红细胞生成、细胞增殖和存活等，它们提供必要的补偿机制来提高氧和其他营养物质的传递。这些改变可以看作机体对损伤的适应性反应，另一方面，它们的表达升高可促进肿瘤的生长和转移[16]。

　　3 HIF-1α与肿瘤血管生成的关系

　　氧稳态的维持是细胞生命活动的基本前提，在发育过程中，细胞生物体获得了一系列机制以适应氧浓度的变化，其中最重要的低氧信号传递因子是HIF-1，它在肿瘤形成中也起着非常重要的作用。当实体瘤超过2mm3大小时，02渗透不能满足细胞代谢需求，肿瘤细胞在增殖则出现障碍，肿瘤若获得继续生长，必须建立一套血管供应系统以进行持续的氧气营养物质的供应。其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被认为[17]是参与肿瘤新生血管形成的主要调控因子，能特异的结合血管内皮细胞，促进内皮细胞生长，增加血管通透性，从而诱导血管生成。而在缺氧条件下调节VEGF的信号传导途径中HIF-1α起关键作用。其功能[18]首先是增强VEGF的转录活性，在VEGF的5’侧翼序列中含有HRE，在其他辅助激活因子的共同作用下，与HIF-1α结合，启动并增强VEGF的转录。其次是增强VEGF mRNA的稳定性。VEGF mRNA的3’非转录区富含AU(腺核苷酸-鸟核苷酸)，缺氧时高表达的RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)和富含AU的元件具有特别的亲和力，避免VEGF mRNA被降解，从而延长其在缺氧状态下的半衰期，加强了VEGF的生物学效应。

　　HIF-1α还通过影响其它生长因子的表达，直接参与血管生成的全过程[19]。在血管生成启动阶段，通过合成NO使血管舒张，上调VEGF及配体的表达而致血管通透性增强;进展阶段，上调金属蛋白水解酶而降解细胞外基质，VEGF诱导血管内皮细胞迁移和增生，同时血管生成素-2的参与下，形成结节状或锥形血管芽;形成阶段，在VEGF、血管生成素1及整合素的作用下，单个血管芽生长变形形成血管腔，并与临近血管芽相互吻合成血管网;塑形和改建阶段，通过血小板衍生生长因子、血管生成素1等，使血管平滑肌或其他细胞迁移包绕新生血管，产生细胞外基质，进而形成完整的血管壁结构。肿瘤中的血管与正常血管组织存在一定的差异，如血管壁不连续、缺乏平滑肌包裹等，来源于肿瘤组织的血管有时并不能有效解决物质和气体的交换，但是对肿瘤的生长和浸润、转移却有重要作用。

　　4 HIF-1α在恶性肿瘤中的表达和作用

　　细胞增殖失控是恶性肿瘤的生长特点之一，肿瘤组织增生过快必然造成局部组织严重缺氧和代谢紊乱。而HIF-1α恰好能通过诱导VEGF和糖酵解相关酶的表达，增加供血、供氧、供能，调和这一矛盾[20]。Zhong等[21]分析了179例肿瘤标本中HIF-1α的表达发现，19种类型肿瘤中有13种包括结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌等HIF-1α呈不同程度的表达，其中结肠、乳腺、前列腺的癌前病变中发现HIF-1α的过度表达，而乳腺、子宫的良性病变中则无HIF-1α过度表达。据此他提出实质性肿瘤的两个主要特征是大量新生血管形成和糖酵解活动增强，这两个特征使肿瘤细胞能适应缺氧的微环境，促进肿瘤的浸润和转移，与肿瘤的不良预后密切相关。

　　HIF-1α在缺氧介导的凋亡及肿瘤细胞增殖中起重要作用。樊利芳等[22]分析60例肺癌细胞HIF-1α表达与凋亡调节基因Bc1-2、Bax及增殖细胞核抗原(PCNA)的关系时提出，Bc1-2的表达与HIF-1α呈负相关，分化差的肺癌组织Bc1-2的表达增高，细胞凋亡相对减少，资细胞获得异常增殖及侵袭的优势。该研究还发现，HIF-1α表达与Bax和PCNA表达呈正相关，且PCNA表达强度越强，细胞增殖活性越高，临床分期越晚，病人预后越差。Bruick报道，Bc1-2家族成员Nix基因启动子存在一个功能性缺氧反应元件，是HIF-1α的直接靶基因。在缺氧条件下细胞内Nix-mRNA水平及Nix蛋白水平升高，从而启动Bc1-2诱导细胞凋亡过程，引发细胞凋亡。但由于缺氧、营养缺乏和其它有害因素的损害造成分化差的肿瘤凋亡指数高于分化程度高者，在肿瘤生长过程中细胞增殖和凋亡相对平衡，恶性度高的肿瘤细胞增殖快，作为机体自我保护机制的凋亡也将增加。

　　总之，HIF-1α调控肿瘤相关基因表达的功能主要有：①促进新生血管形成，给瘤细胞的侵袭和转移创造条件。HIF-1α可以通过参与调节肿瘤内新生血管的生成影响肿瘤的生成，目前已发现血管丰富的肿瘤较血管较少的肿瘤有更高的转移率。②HIF-1α可促进13种不同的糖酵解酶类产生，糖酵解的增强不仅可使肿瘤细胞适应周围不利的环境而且可以减少有氧代谢中反应性氧类(ROS)对细胞DNA修复的破坏。实质性肿瘤内普遍存在缺氧区域，以缺氧为显著特征的实质性肿瘤微环境是肿瘤细胞遗传不稳定性基本始动因素[23]。③编码P53、P21蛋白的两个基因都参与细胞周期的调节，在缺氧条件下诱发细胞凋亡，但缺氧作为一种生理性的选择，介导肿瘤细胞的恶性筛选，这些细胞被筛选并存活下来，促进了肿瘤的恶性转化。

　　5 E-cad在肺癌组织中的表达及意义

　　多数工作者已明确证实E-cad的黏附能力的散失是获得去分化和有侵袭力表型的关健一步，Hermiston等[24]发现上皮细胞E-cad的正常表达能抑制细胞的游走和增殖，E-cad表达下调则使细胞连接松散，刺激细胞的增生游走，有利于肿瘤浸润扩散。实验发现在肺癌中E-cad在癌巢中心区的表达与在周边区的表达是不一致的，在中心区表达正常，而在周边区表达减少或缺失。失去E-cad膜表达的肿瘤细胞黏附功能降低，肿瘤细胞易于从原发部位脱落，这一现象可能在肿瘤的扩散中起关键性的启动作用。有报道，通过免疫荧光、Western和Northern blotting等方法对不同分化的人体肺癌、膀胱癌、乳腺癌和胰腺癌细胞系研究发现，高分化细胞系在细胞培养中维持上皮表型，一般有膜E-cad表达，而低分化细胞系显示成纤维细胞样表型，失去原有E-cad表达。Brabletz等发现在结、直肠癌，浸润边缘肿瘤细胞获得去分化表型，其特点是小管的开放和小细胞串的脱离、最后成为孤立的肿瘤细胞。这些孤立的细胞失去极性，显示成纤维细胞样的形态并有时有Vimentin的弱表达。浸润前沿的肿瘤细胞获得去化分的间质样表型、显示成纤维细胞样形态是恶性肿瘤浸润和转移的前提。这些成纤维细胞样肿瘤细胞可能代表肿瘤中最具侵袭力的癌细胞群。肿瘤是复杂的组织，由肿瘤细胞、正常基质细胞和细胞外基组成且相互作用。细胞外基质通过对整合素连接激酶的激活导致E-cad基因的表达改变。

　　在影响E-钙粘蛋白复合体功能发挥的多种因素中，肿瘤克隆性增生造成肿瘤内部缺氧问题越来越多地被医学界所重视。HIF-1α mRNA表达水平受到氧浓度的调控，低氧时HIF-1mRNA表达明显增加，当转入正常氧浓度时，其量迅速下降。HIF-1α调节的基因涉及细胞能量代谢、离子代谢、血管发生及舒缩控制，它介导转录的因子有红细胞生成素、血管内皮生长因子[26]、糖酵解酶的基因等。由于HIF-1α的中枢纽带作用，上述因子发生一系列变化，最弹簧门引起新的血管形成使肿瘤细胞能够适应缺氧微环境，从而使得肿瘤持续生长和扩散及转移。aImai[27]等对76例卵巢癌患者进行E-钙粘蛋白及HIF-1α检测表明低氧时HIF-1α能通过其下游因子SNAIL对E-钙粘蛋白复合体的表达进行下调，从而引起卵巢癌的侵袭和转移。也有相关研究表明在缺氧和组织坏死的情况下细胞可以释放EGF和TNF-α增加E-钙粘蛋白复合体的解体，导致细胞侵袭能力增加和β-连环素在细胞内积聚，当胞浆中的β-连环素积聚到一定水平时，β-连环素进入核内激活靶基因。肺癌中β-连环素呈现过度表达，推测肺癌细胞中β-连环素的增加可能与肺癌细胞的高增殖和肺癌预后有关，有相关报道减少肺腺癌中β-连环素，患者预后较差。由于β-连环素具有介导细胞黏附的功能，其功能效应复杂。此外，肺癌中β-连环素很少突变，多数是量的变化，而无质的改变。

　　HIF-1α表达升高者伴有E-Cadherin表达降低，这种现象充分说明HIF-1a/E-Cadherin途径在介导细胞黏附和维持细胞结构方面起着关键作用。E-Cadherin的黏附功能依赖于Cadherin-catenin-acein总体的完整性[28]，任何导致其解体都会使黏附能力下降，而使肿瘤细胞脱离瘤体，引起肿瘤细胞扩散和继发瘤形成。但是研究表明有些高度恶性的病例中可见到E-Cadherin功能状态可能存在异常，破坏了细胞间的连接机制，或者同时存在其他途径同时对E-Cadherin的表达起调控作用。

　　随着肿瘤继续生长，缺氧加重，HIF-1α水平更高，考虑在低分化的肿瘤中，可能存在更多的癌基因激活或者抑癌基因失活，从而减慢了HIF-1α的降解，同时更增加了它在胞内的水平。

　　虽然HIF-1α能通过对多种靶基因的调控促进肿瘤的侵袭和转移。但是肿瘤细胞的侵袭和转移取决于侵袭启动因素及侵袭抑制因素的平衡。一个重要的侵袭抑制复合物就是由E-钙粘蛋白通过连接素与肌动蛋白细胞骨架连接形成的。E-Cadherin是钙离子依赖的同质亲和性细胞黏附分子，以同源二聚体的形式广泛分布于组织中，维持细胞的极性、形态和结构的完整性。E-Cadherin表达的散失或下降与肿瘤的低分化、高侵袭、淋巴结转移及远处转移的发生和高复发率成正比相关。E-钙粘蛋白通过E-钙粘蛋白复合体发挥作用，因此无论是E-钙粘蛋白本身或其他组分的改变均可影响其功能的发挥，导致其失活而影响细胞间黏附和细胞生长周期。

　　在多种恶性肿瘤中，HIF-1α和E-cad的表达呈负相关性，而且在运用腹腔镜对一些肿瘤作微创手术的方面已有相关研究，结果表明减少缺氧环境会改变一些肿瘤的生物学行为，从而减少肿瘤的浸润和转移。

　　7 展望

　　HIF-1α作为调节肿瘤细胞适应缺氧的核心转录因子，参与多种基因的转录调控和肿瘤细胞对缺氧的适应过程。通过调节肿瘤内新生血管的生长和能量代谢，从而增强了肿瘤细胞在缺氧环境下的生存能力，促进细胞的增殖，导致肿瘤的发展和恶性变。因此，通过对HIF-1α基因生成的影响因素和调控因素的进一步阐明，有助于深入认识恶性肿瘤的病理机制，并可望通过各种方法降低HIF-1α的表达水平为恶性肿瘤治疗寻找新的有效靶点。

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