C反应蛋白基因启动子T757C多态性与不稳定性心绞痛的关系

　　作者：戚猛,何国平,高,磊,沈丹丹,金　　作者单位：1.江苏大学附属武进医院心内科，江苏 常州 ;2.南京医科大学第一附属医院心血管病研究所，江苏 南京

　　【摘要】目的： 探讨中国苏皖地区汉族人群C反应蛋白(Creaction protein, CRP)基因启动子T757C多态性与不稳定性心绞痛(unstable angina pectoris, UAP)的可能关系。方法： 采用病例对照研究方法，以165例UAP 患者(病例组)和282例非冠心病者(对照组)作为研究对象，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism，PCRRFLP)方法检测CRP基因T757C多态性。结果： 与对照组相比，UAP组的TT，TC和CC基因型频率比较均无统计学意义(P值均>0.05)。 T等位基因频率在UAP组和对照组分别为77.6%和79.1%，两组间差异无统计学意义(P>0.05)。多元Logistic回归分析显示CRP基因T757C多态性与UAP的发生无显著性关联(P>0.05)。 结论： 在中国苏皖地区汉族人群中，CRP基因启动子T757C多态性与UAP无显著相关性。

　　【关键词】 C反应蛋白; 基因多态性; 不稳定性心绞痛

　　Association of Creaction protein gene T757C polymorphism in the promoter region with unstable angina pectoris QI Meng1， HE Guoping1， GAO Lei1， SHEN Dandan1， JIN Mingfeng1， ZHANG Jinan2 (1.Department of Cardiology, Affiliated Wujin Hospital of Jiangsu University, Changzhou Jiangsu 213002;2.Institute of Cardiovascular Disease, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing Jiangsu 210029, China) [Abstract] Objective: To investigate the possible association between Creaction protein(CRP) gene T757C polymorphism in the promoter region and unstable angina pectoris(UAP) in a Chinese Han population of Suwan region. Methods： This study was conducted with a casecontrol design including 165 patients with UAP(UAP group) and 282 control subjects who were free from coronary artery disease(control group). The T757C polymorphism in CRP gene was determined by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. Results： Compared with the control group, the frequencies of TT，TC and CC genotype were not significantly different in UAP group(P>0.05). The prevalence of T allele was 77.6% and 79.1%(P>0.05) respectively in the UAP group and control group. Multivariate logistic regression analysis indicated that there was no significant correlation between CRP gene T757C polymorphism and UAP(P>0.05). Conclusion： Our findings suggest that the T757C polymorphism in CRP gene may be not the risk for UAP among the Chinese Han population of Suwan region.

　　[Key words] Creaction protein; gene polymorphism; unstable angina pectoris

　　不稳定性心绞痛(unstable angina pectoris, UAP)是冠状动脉内不稳定的粥样斑块继发病理改变，使局部心肌血流量明显下降。不稳定粥样斑块的肩部是最常发生破裂的部位，而此处C反应蛋白(Creaction protein, CRP)沉积较多[1]。CRP主要由白介素6通过剂量依赖方式刺激肝细胞及活化巨噬细胞合成，可促进血管内皮细胞增生、迁移、动脉内膜增厚;具有调节单核细胞聚集作用, 与膜攻击复合物共同存在于早期动脉粥样硬化病变内，造成血管内膜损伤;刺激血管内皮细胞，导致细胞间黏附因子1的分泌，诱导内皮细胞致炎因子的表达，造成血管进一步损伤[2,3]。

　　基因组学研究表明[4,5]，CRP基因变异对机体血清CRP水平发挥了35%～50%的作用;然而，最近CRP基因多态性与冠心病(coronary artery disease, CAD)的相关性研究仍存在争议[5-8]。

　　本研究旨在探讨中国苏皖地区汉族人群CRP基因启动子T757C多态性分布及其与UAP的相关性。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1 病例组 选自2003年11月～2008年5月在江苏大学附属武进医院、南京医科大学第一附属医院住院的UAP患者165例为病例组，其中男120例，女45例，年龄41～83岁，平均(65.90±8.72)岁，病例均符合2002年AHA/ACC关于UAP的诊断标准。

　　1.1.2 对照组 同期门诊或住院者，经相关检查排除CAD，共282例，男166例，女116例，年龄38～90岁，平均(62.10±11.81)岁。所有入选者均为中国苏皖地区汉族人，且无血缘关系，均排除充血性心力衰竭、心肌病、心脏瓣膜病、肝脏和肾脏疾病等。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 基因组DNA提取 外周血DNA提取抽取入选者外周静脉血3 ml，32 g/L柠檬酸钠抗凝，离心分离血浆及白细胞，以酚氯仿法抽取外周血白细胞基因组DNA。

　　1.2.2 目的DNA片段扩增 引物由大连宝生物工程有限公司合成，上游引物为5′GTAGTAAGATTGACAGACAG3′，下游引物为5′TTCTCATTGTTCAATTCCCA3′。PCR反应体系：总体积为50 μl，包括10×反应缓冲液5 μl，镁离子终浓度为2.0 mmol/L，四种脱氧核糖核苷酸终浓度为0.2 mmol/L，上下游引物各20 pmol，Taq DNA聚合酶1.25 U和模板DNA 100 ng。PCR反应条件：94℃预变性5 min，接着94℃变性1 min，53℃退火48 s，72℃延伸48 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。反应结束后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，通过凝胶成像分析系统观察PCR扩增结果。

　　1.2.3 多态性测定 取PCR扩增产物4 μl，限制性内切酶MfeⅠ2 U，10×酶切缓冲液2 μl，无菌去离子水补足总体积至20 μl，混匀，37℃温育11 h。酶切产物经3%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统判断基因型。取部分PCR扩增产物进一步测序鉴定。

　　1.2.4 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料结果以±s表示，两组间比较用t检验，研究对象组间基因型及等位基因频率比较采用四格表χ2检验。应用多元Logistic回归分析基因型与UAP的相关性，关联程度用优势比(odds ratio, OR)和95%可信区间(confidence interval, CI)表示。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 UAP组与对照组临床资料比较

　　两组血压、血糖(Glu)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平及吸烟比例等比较差异无统计学意义。UAP组年龄水平明显高于对照组(表1)。表1 UAP组和对照组一般临床资料比较

　　2.2 CRP基因T757C多态性分析及PCR产物测序

　　PCR扩增产物为314 bp的特异性片段，根据限制性内切酶MfeⅠ酶切片段的情况，本研究检测到3种基因型：CC型(314 bp)、TC型(314 bp，234 bp，80 bp)和TT型(234 bp，80 bp)(图1)。PCR 产物经测序进一步验证(图2)。

　　2.3 CRP基因T757C多态性分布特点及其与UAP的关系

　　TC，TT和CC基因型频率在UAP组和对照组的分布均无统计学差异。T等位基因频率在UAP组和对照组分别为77.6%和79.1%，两组间差异无统计学意义(表2)。在调整SBP，DBP，Glu，TG，LDL，HDL，吸烟等危险因素并经多元Logistic回归分析后显示，CRP基因T757C多态性与UAP的发生无显著性关联。表2 UAP组和对照组CRP基因T757C多态性分布

　　3 讨 论

　　炎症在动脉粥样硬化斑块的发生、发展中起着重要作用。CRP作为一种炎症时相非特异性反应蛋白，被认为是预测未来心血管危险较有力的炎症标志物之一[9]。张晓梅等[10]研究证实高水平的CRP与UAP的发生有关，并可预测其预后。CRP基因位于人类染色体1q13.2区域，全长约6.8 kb，包含两个外显子，中间由一个内含子隔开[11]。Danik等[12]研究发现CRP基因启动子T757C多态性与欧裔美国急性冠状动脉综合征患者的血清CRP水平升高显著相关。功能学研究表明[7]，CRP基因启动子-286C>T>A这种单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)可影响转录因子的结合以及调节转录活性，并证实其为功能性多态性位点。有研究发现[11]，CRP基因-757T>C多态性与-286C>T>A多态性位点存在强的连锁不平衡。由此我们推测-757T>CSNP变异可能影响转录的过程，也有可能其本身就影响启动子的活性，从而影响基础血清CRP水平，促进动脉粥样硬化的发生、发展。然而，Miller等[5]在美国人群中研究发现，CRP基因T757C基因多态性与心肌梗死(myocardial infarction, MI)的发病无相关性。Wang等[8]以白裔美国人群为对象的研究中，发现CRP基因启动子T757C多态性与CAD的发生无相关性。

　　本研究检测了UAP患者和对照组CRP基因T757C多态性，结果显示CRP基因T757C多态性与UAP的发生无显著相关性;T等位基因频率在UAP组和对照组分别为77.6%和79.1%，两组间差异无统计学意义。本研究结果与上述国外报道基本一致，分析其原因，首先最大可能为UAP，CAD及MI的发病机制和病理生理不同，该位点的多态性变异对UAP，CAD及MI的作用可能不同。其次为样本的不均一性，如性别、发病年龄、种族以及地域等。再者设计不完全相同和样本量偏小也会使得许多研究结果趋于相同。因此，有必要建立一个关于UAP，CAD及MI不同人种的多中心、大样本基因数据库，以及在功能学方面进一步深入研究，进一步补充冠状动脉疾病的基因信息。

　　综上所述，本文首次报道CRP基因启动子T755A多态性可能不是中国苏皖地区汉族人群UAP的易感性位点和预测指标，为UAP患者的基因学研究和一级康复干预补充了实验室数据，为UAP的发病机制研究、危险因素评价以及防治提供新的思路。

　　【参考文献】

　　[1] Torzewski J, Torzewski M, Bowyer DE, et al. Creactive protein frequently colocalizes with the terminal complement complex in the intima of early atherosclerotic lesions of human coronary arteries[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,1998,18(9):1386-1392.

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　　[3] Zwaka TP, Hombach V, Torzewski J. Creactive proteinmediated low density lipoprotein uptake by macrophages: implications for atherosclerosis[J]. Circulation, 2001, 103(9):1194-1197.

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　　[7] Szalai AJ, Wu J, Lange EM, et al. Singlenucleotide polymorphisms in the Creactive protein(CRP) gene promoter that affect transcription factor binding, alter transcriptional activity, and associate with differences in baseline serum CRP level[J]. J Mol Med, 2005, 83(6):440-447.

　　[8] Wang Q, Hunt SC, Xu Q, et al. Association study of CRP gene polymorphisms with serum CRP level and cardiovascular risk in the NHLBI Family Heart Study[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006, 291(6):H2752-H2757.

　　[9] Ridrer PM. Highsensitivity Creactive protein: potential adjunct for global risk assessment the primary prevention of cardiovascular disease[J]. Circulation, 2001, 103(13):1813-1818.

　　[10] 张晓梅，王家平.不稳定型心绞痛患者血C反应蛋白、血沉和白细胞联合测定的意义[J].江苏大学学报：医学版，2003，13(13)：398-399.

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