小型化免疫偶联物Fab-ADM抗肿瘤机制的初步探讨

　　李　灵1 ，黄风迎1 ，黄幼生2 ，郭峻莉1 ，黄用豪1 ，王 　华1 作者单位：(海南医学院1.海南省热带病重点实验室，2.病理学教研室，海南 海口　571101)

　　【摘要】 目的： 探讨小型化的免疫偶联物Fab-ADM的抗肿瘤机制。方法： 建立小鼠肝癌细胞H22及小鼠黑色素瘤细胞B16的皮下移植瘤模型，分别予以生理盐水及ADM、Fab-ADM治疗，治疗结束后取肿瘤组织制备石蜡切片进行HE染色，并通过CD34进行免疫组织化学染色以计数肿瘤微血管。结果： 在2种动物模型中，Fab-ADM治疗组小鼠瘤体内可见肿瘤细胞的大片状坏死，微血管密度明显减少，与生理盐水对照组及ADM治疗组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论：Fab-ADM偶联物较游离ADM具有更强的肿瘤抑制作用，其可显著抑制肿瘤微血管密度的增加，继而引起肿瘤细胞的大面积坏死。

　　【关键词】 Fab-ADM偶联物 ;微血管密度; 抗肿瘤机制

　　[ABSTRACT] Objective： To investigate the anti-tumor mechanism of dowmsized immunoconjugate Fab-ADM. Methods： Preparing hepatocarcinoma H22 and melanoma B16 tumor-bearing mice and separated them into three groups， treated with normal saline， adriamycin and immunoconjugate Fab-ADM， respectively. SP immunohistochemistry method was used to detect the expression of CD34. Results： For two mice tumor models， the tumor cells appeared large area necrosis in Fab-ADM treated group， and microvessel density also decreased significantly(P<0.05) compared with the normal saline and adriamycin treated groups. Conclusion： Treatment with Fab-ADM supressed increasing of tumor microvessel density significantly， and then causeed large area necrosis， which may be the mechanism of Fab-ADM treatment effection.

　　[KEY WORDS] Immunoconjugate Fab-ADM;MVD;Anti-tumor mechanism

　　Endoglin是转化生长因子β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)和细胞表面受体结合的辅助分子[1,2]，和肿瘤血管生成密切相关。Endoglin选择性高表达于肿瘤新生血管的内皮细胞，是肿瘤血管生成的标志性分子。阿霉素(adriamycin，ADM)属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用，是一种广谱的抗肿瘤抗生素。本课题组以Endoglin为靶点，将小型化抗Endoglin单抗(抗体小型化，即通过酶切方法获得单抗Fab片段，其分子质量约相当于完整抗体的1/3)与阿霉素偶联。前期的小鼠体内实验已初步证明偶联物Fab-ADM较ADM有较强的抗肿瘤作用。为进一步探明所得偶联物的抗肿瘤作用机理，本研究利用CD34标记肿瘤组织标本中的微血管，比较偶联物与游离阿霉素对肿瘤微血管密度的影响，初步阐释偶联物的肿瘤抑制机制。

　　1　材料与方法

　　1.1 　材料

　　1.1.1 　细胞株及实验动物

　　小鼠肝癌细胞株H22及小鼠黑色素瘤细胞株B16购自中国典型培养物保藏中心;清洁Ⅱ级雄性昆明种及雄性C57BL/6小鼠，体重18～22 g，由广东省医学实验动物中心提供。

　　1.1.2 　试剂

　　盐酸阿霉素为意大利Pfizer Italia S.r.l.公司产品，Fab-ADM偶联物为本实验室制备，细胞培养用RPMI 1640培养基及FBS购自Gibco公司，兔源抗CD34单抗及石蜡切片的免疫组化相关试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，其他常规生化试剂均为国产分析纯。

　　1.2 　方法

　　1.2.1 　小鼠肝癌模型建立及偶联药物治疗

　　选取体重18～22 g的雄性昆明种小鼠待用。小鼠肝癌细胞株 H22经小鼠腹腔传代1次，收集腹水细胞，以生理盐水将细胞密度稀释至约1.2×107个/mL，以0.2 mL/只的剂量接种于小鼠右腋皮下。待肿瘤生长至约4 mm×6 mm大小时，开始尾静脉注射给药。对照组给予生理盐水0.2 mL/只，ADM治疗组给予0.4 mg/kg 的ADM;Fab-ADM治疗组采用的偶联物剂量为17.8 mg/kg(由于此时偶联物中ADM的剂量仍为0.4 mg/kg，故为ADM治疗组的等细胞毒性剂量)。每周给药1次，连续3周。

　　1.2.2 　小鼠黑色素瘤模型建立及偶联药物治疗

　　选取体重18～22 g的雄性C57BL/6小鼠待用。小鼠黑色素瘤细胞B16于PRMI 1640完全培养液中生长至对数期，收集细胞、计数，并以生理盐水将细胞密度稀释至约1×107个/mL，以0.1 mL/只的剂量接种于小鼠背部皮下。待肿瘤生长至约4 mm×6 mm大小时，开始尾静脉注射治疗用药。治疗方式同“1.2.1项”。

　　1.2.3 　肿瘤组织切片、染色

　　采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)免疫组织化学方法检测组织CD34的表达。用药22 d后，各组小鼠均断颈处死;整块切除的皮下肿瘤经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片3张，厚4 μm;其中一张切片进行HE染色，另一张切片贴于经L-多聚赖氨酸处理的玻片，50℃烘片2 h后进行免疫组织化学染色。染色步骤按试剂盒说明书进行。

　　1.2.4　微血管密度(microvessel density，MVD)的测定

　　微血管计数标准：以CD34染色阳性计数微血管，采用Weidner 等[3]报道的方法：先用100 ×倍光镜扫视整个切片，寻找血管最密集区，即“热点”。然后在200 倍视野下计数微血管数量。每张切片计数3 个视野，取3 个视野的平均值为该张切片的微血管密度。微血管的判断标准为任何与其邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开的染成棕黄色血管内皮细胞或血管内皮细胞簇，即视为一个微血管，只要结构不相连，其分支结构也作为一个微血管计数。血管腔和红细胞不记作微血管，有厚的平滑肌及管腔直径大于8个红细胞的血管亦不记作微血管。

　　1.3 　统计学处理

　　采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据以x-±s表示，组间比较采用独立样本t 检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 　结果

　　2.1 　HE染色结果

　　小鼠肝癌(图1A～C)和黑色素瘤(图2A～C)组织HE染色结果均显示：在生理盐水对照组中，肿瘤细胞呈巢、片状分布，生长活跃，间质血管丰富，坏死少见;ADM治疗组中肿瘤细胞有小灶状坏死，间质血管亦较丰富;Fab-ADM治疗组可见大片状坏死，间质血管较对照组明显减少。A：生理盐水对照组;B：ADM治疗组;C：Fab-ADM治疗组图1 小鼠肝癌组织的HE染色(10×10)A：生理盐水对照组;B：ADM治疗组;C：Fab-ADM治疗组图2 小鼠黑色素瘤组织的HE染色(10×10)

　　2.2 　免疫组织细胞化学染色结果

　　计数CD34阳性的微血管。小鼠肝癌(图3 A～C)组织中MVD的计数结果：生理盐水对照组为43.33±4.96，ADM治疗组为37.91±9.38，Fab-ADM偶联物治疗组为16.25±7.62，Fab-ADM偶联物治疗组与对照组及ADM治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05);小鼠黑色素瘤(图4 A～C)组织中MVD的计数结果：生理盐水对照组为54.17±6.77，ADM治疗组为40.08±8.18，Fab-ADM偶联物治疗组为15.00±1.73，Fab-ADM治疗组与对照组及ADM治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明Fab-ADM偶联物在体内可显著抑制肝癌及黑色素瘤的肿瘤血管生成。A：生理盐水对照组;B：ADM治疗组;C：Fab-ADM治疗组图3 CD34在小鼠肝癌组织中的表达(SP10×10)A：生理盐水对照组;B：ADM治疗组;C：Fab-ADM治疗组图4 CD34在小鼠黑色素瘤中的表达(SP10×10)

　　3 　讨论

　　肿瘤的生长和转移受多种因素的影响。其中，肿瘤内的微血管密度是影响肿瘤生物学特征的重要因素之一。肿瘤微血管密度的增高，增加了肿瘤的供血，利于肿瘤的生长[4]。此外，肿瘤内的增生微血管在形态和结构上存在明显缺陷，其基底膜较为薄弱且存在较大的裂隙，使肿瘤细胞能够容易地通过有缺陷的微血管进入血液循环进而发生远端转移[5]。因此，有效抑制肿瘤微血管的生成是抑制肿瘤生长和转移的有效途径。

　　Endoglin是抗肿瘤血管生成的理想治疗靶点。如Li等[6]利用抗Endoglin单克隆抗体的被动免疫治疗有效抑制了肿瘤血管生成，加速了肿瘤细胞的凋亡。由于抗血管生成治疗的直接靶标不是肿瘤细胞，即使治疗有效，全部肿瘤血管消失，但少量肿瘤细胞可以不通过血管而从周围组织直接吸收营养物质而长期存活，因此单纯的抗血管生成治疗难以根治肿瘤，或可能需要长期的治疗。已有研究发现，Endoglin与化疗药物联合应用可提高疗效[7]。于是我们设想，若将Endoglin和化疗药物(如具有广谱抗肿瘤作用的抗生素阿霉素)偶联后使用，既可利用Endoglin靶向肿瘤新生血管的特点，与其偶联的阿霉素又可杀灭肿瘤细胞，弥补单独使用抗体时的不足，具有一定的应用潜力。偶联物的制备选用异型双功能偶联剂MBS(m -Maleimidobenzoyl- N-hydroxysuccinimide ester)作为交联剂，MBS首先与一含有-NH2的分子(在本实验中为ADM)反应并稳定结合为活性的中间产物，然后再与一含有-S-的分子(本实验中为经胃蛋白酶消化、DTT还原的抗体Fab片段)反应得到终产物，即Fab-ADM偶联物。所得偶联物分子量约52 kDa，偶联物中Fab与ADM的分子比约为1∶2。小鼠肝癌 H22皮下移植瘤模型观察其体内抗肿瘤作用，结果显示偶联物较游离ADM不但有更强的肿瘤抑制效果(P <0.05)，还可显著延长荷瘤动物的生存时间(P <0.01)。本研究通过免疫组织化学染色计数CD34染色阳性的肿瘤微血管密度，结果显示，偶联物Fab-ADM较游离ADM具有更强的肿瘤抑制作用是因为其可显著抑制肿瘤微血管密度的增加，继而引起肿瘤细胞的大面积坏死。由此判定，本实验室构建的小型化偶联物Fab-ADM有望成为新型的抗肿瘤药物。

　　【参考文献】

　　1　Fonsatti E， Sigalotti L， Arslan P， et al. Emerging role of endoglin (CD105) as a marker of angiogenesis with clinical potential in human malignancies[J]. Curr Cancer Drug Targets， 2003， 3(6)： 427-432.

　　2　Duff SE， Li C， Garland JM， et al. CD105 is important for angiogenesis： evidence and potential applications[J]. FASEB J,2003,17： 984-992.

　　3　Weidner N， Semple JP， Welch WR， et al. Tumor angiogenesis and metastasis -correlation in invasive breast carcinoma[J]. N Engl J Med,1991， 324： 1-8.

　　4　Ellis LM，Fidler IJ. Angiogenesis and metastasis[J]. Eur J Cancer,1996， 32A： 2451.

　　5　秦净，徐世中，张轶斌，等. 胃癌组织微血管密度的临床病理意义[J]. 肿瘤，1999,19(3)：166-168.

　　6　LI Yue- nan， TAN Guang- hong， JIAO Jie- ge， et al. Establishment of a rat hybr idoma cell line secreting monoclonal antibody against extracellular domain of murine endoglin[J]. China Journal of Modern Medicine， 2007， 17(1)： 1-4.

　　7　Takahashi N， Haba A， Matauno F，et al. Antiangiogenic therapy of established tumors in human skin/severe combined immunodeficiency mouse chimeras by anti-endoglin (CD105) monoclonal antibodies， and synergy between anti-endoglin antibody and cyclophosphamide[J].Cancer Res， 2001,61：7846-7854.