骨巨细胞瘤中ＭＭＰ-９和ＴＩＭＰ-３的表达及临床意义

　　作者：曾弘,文剑明,李海刚,沈溪明,吴　　作者单位：1. 中山大学附属第二医院病理科， 广东 广州 510120; 2. 中山大学附属第一医院病理科， 广东 广州

　　【摘要】【目的】 研究骨巨细胞瘤组织中基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9， MMP-9)及其特异性抑制剂金属蛋白酶组织抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3， TIMP-3)的表达及临床意义。【方法】 用免疫组化SP法检测45例骨巨细胞瘤组织中MMP-9、TIMP-3的表达情况，以CD31标记检测微血管密度(micro vessel density，MVD)。【结果】 骨巨细胞瘤组织中MMP-9、TIMP-3阳性率分别为100%和91%，MMP-9表达与MVD水平存在正相关性(?字2 = 14.812，P = 0.001)，而且两者在复发组均显著高于非复发组(?字2 = 18.250，P = 0.000; t = -8.14， P = 0.000)，但TIMP-3在两组的表达在统计学上无明显差异，此外MMP-9、TIMP-3及MVD与组织学分级无关。【结论】 MMP-9、TIMP-3表达的不平衡可能会加速肿瘤血管形成并影响骨巨细胞瘤的复发。

　　【关键词】 骨巨细胞瘤; 基质金属蛋白酶; 金属蛋白酶组织抑制因子; 新生血管化

　　Clinical Significance of Matrix Metalloproteinase-9， Tissue Inhibitors of Metalloproteinase-3 Expression in Human Giant Cell Tumor of Bone

　　ZENG Hong1， WEN Jian-ming2， LI Hai-gang1， SHEN Xi-ming1， WU Dong-xia1

　　(1. Department of Pathology， The Second Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510120， China;

　　2. Department of Pathology， The First Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510089， China)

　　Abstract： 【Objective】 This study was designed to investigate the clinical significance of matrix metalloproteinase-9， tissue inhibitors of metalloproteinase-3 expression in human giant cell tumor of bone. 【Methods】 The expression of MMP-9， TIMP-3 and micro vessel density were detected by immunohistochemical staining with monoclonal antibodies against MMP-9， TIMP-3 and CD31 in 45 cases of giant cell tumor of bone. 【Results】 The positive rates of expression of MMP-9， TIMP-3 were 100% and 91%，respectively. The expression levels of MMP-9 was correlated positively with MVD(?字2 = 14.812，P = 0.001)，and both of them were significantly higher in recurrence group than in non-recurrence group of the tumor(?字2 = 18.250，P = 0.000;t = -8.14，P = 0.000)， but no statistically difference was found in the expression level of TIMP-3 between the two groups. Moreover expressions of MMP-9， TIMP-3 and MVD have no relationship with histological grading of the tumor. 【Conclusion】 The imbalance between the changes of MMP-9 and TIMP-3 may accelerate angiogenesis and affect the recurrence of giant cell tumor of bone.

　　Key words： giant cell tumor of bone (GCT); matrix metalloproteinase-9 (MMP-9); tissue inhibitors of metalloproteinase-3(TIMP-3); angiogenesis

　　骨巨细胞瘤(GCT)在WHO新分类中被描述为“侵袭性的潜在恶性病变”，表现为高侵袭性、高复发率，但是目前尚无确切的组织学指标能反映其生物学行为。肿瘤细胞侵袭和肿瘤新生血管的形成均需要蛋白酶的作用，基质金属蛋白酶MMP-9和金属蛋白酶组织抑制因子TIMP-3的表达失衡与多种肿瘤的侵袭转移和复发有关[1-2]，本研究采用免疫组化的方法，检测45例骨巨细胞瘤组织MMP-9、TIMP-3的表达，并探讨它们与肿瘤血管形成及复发的关系，为判断骨巨细胞瘤预后寻找可靠的指标。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　骨巨细胞瘤标本取自1993年3月至2000年5月中山大学附属一院及二院骨外科手术切除的组织，选择肿瘤复发病例19例，非复发病例26例，共45例，男21例，女24例，年龄15 ～ 67岁(中位年龄30岁)。肿瘤组织用40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，进行免疫组化染色。

　　1.2 免疫组化

　　小鼠抗人MMP-9(GE-213)和CD31(JC70A)购自DAKO公司，TIMP-3(IM43L)购自Oncogene 公司， SP试剂盒均购自福州迈新公司。石蜡切片厚4 μm，其中CD31染色前先行高温高压抗原修复。其余步骤按SP法进行，最后DAB显色，苏木素对比染色。以PBS代替一抗作阴性对照，以结肠癌及绒毛组织做阳性对照。

　　1.3 结果判断及统计分析

　　对于MMP-9和TIMP-3，细胞质或细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。随机选择有代表性的10个高倍视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，着色程度(基本不着色、着色淡、着色适中和着色深者分别为0、1、2、3分)与着色细胞百分率(着色细胞百分率 < 5%为0分，5% ～ 25%为1分，26% ～ 50%为2分， > 50%为3分)的乘积，≤ 1分为(-)，2 ～ 4分为(+)，5 ～ 7分为(++)，≥8分为(+++)。微血管密度(micro vessel density，MVD)计数[3]：任何被CD31染成棕黄色的内皮细胞或与邻近微血管、肿瘤细胞之间存在明显分离的内皮细胞团，均按独立的微血管计数，是否有血管腔不作为判断微血管的必要条件，但血管腔大于8个红细胞面积或血管周围有平滑肌包绕的较大血管不纳入计数范围。低倍镜下选择血管密度最高的区域，400倍镜下(0.216 mm2/视野)计数，取5个视野的平均值。统计采用方差分析，t检验和非参数检验，在SPSS8.0统计软件包中进行。

　　2 结 果

　　2.1 组织学分级

　　根据常规的骨巨细胞瘤病理形态分级法[4]，本组病例Ⅰ级8例，Ⅱ级27例，Ⅲ级10例。

　　2.2 复发追踪

　　复发病例19例，占本组病例42.2%，其中最短复发时间为3个月，最长为84个月，平均为27.6个月。另26例追踪时间长达60个月，未见复发。

　　2.3 免疫组化

　　免疫组化显示MMP-9表达于大部分的多核巨细胞及个别的单核基质细胞胞浆。在多核巨细胞的胞浆内，MMP-9的表达分布不均匀，在细胞皱褶缘处表达强烈，具有明显的极向性。还可以见到MMP-9表达阳性的多核巨细胞进入血管，此外，MMP的表达在肿瘤与周围组织的交界处更为明显。TIMP-3表达于多数单核基质细胞及多核巨细胞的胞质和胞膜。在肿瘤周围反应性成骨灶的成骨细胞和骨细胞，也可见TIMP-3呈强阳性。统计结果显示： MMP-9和 TIMP-3阳性率分别为100%和91%，MMP-9的表达和MVD在复发组和非复发组之间的差异有显著性意义(?字2 = 18.250，P = 0.000;t = -8.14，P = 0.000)，MMP-9与MVD存在正相关性(?字2 = 14.812，P = 0.001)，但TIMP-3的表达在复发组和非复发组之间的差异无显著性意义(?字2 = 0.059，P > 0.05)。MMP-9、TIMP-3的表达及MVD与组织学分级无关(非参数检验P > 0.05)。

　　3 讨 论

　　骨巨细胞瘤虽然是一种潜在恶性的肿瘤，但其侵袭性生长，术后复发率高达20% ～ 50%[5-6]。在临床病理诊断中，沿用多年的Jaffe病理组织分级法[4]不能正确反映其生物学行为的良恶性，对指导治疗和判断预后无明显价值。临床上，由于手术方式选择不当，相当数量的患者要经历多次复发及手术，严重影响了生活和生产。因此，需要寻找一种可靠的指标来判断该肿瘤的生物学行为。

　　MMP是一类与肿瘤的侵袭和转移关系十分密切的蛋白水解酶，其中以MMP-9尤其重要，研究证实MMP-9高表达与多种肿瘤的恶性行为和预后有关[1，7-8]。它属于Ⅳ型胶原酶(明胶酶)，在肿瘤浸润转移过程中，不仅可以发挥蛋白水解酶的作用，降解以Ⅲ型、Ⅳ型胶原为主要成分的细胞外基质和血管壁基膜，它对肿瘤血管的形成也是必不可少的。研究[9]显示MMP除了直接参与组织破坏外，还是人体内重要的血管生成诱导和调控因子，它能诱导血管内皮细胞生长因子VEGF的生成，进而刺激内皮细胞合成蛋白酶，促进了内皮细胞的增殖和迁移。因此，可以认为MMP是介导肿瘤恶性生物过程的重要介质。本研究结果也显示预后不良的复发病例MMP-9表达和肿瘤血管形成均高于非复发病例，而且MMP-9表达与MVD正相关。

　　TIMP-3是TIMP家族的新成员[10]，与其它成员的不同之处在于它是一种非可溶性蛋白，与细胞外基质成分紧密结合，在局部发挥作用，因此其对MMP活性的抑制及其它生物学功能的发挥比其它TIMP更有针对性。TIMP-3可与MMP-9按1：1的比例形成特异性复合物，阻断后者活性的发挥。在肿瘤血管形成方面，TIMP-3 可通过对MMP-9 的抑制而阻止细胞外基质的降解和MMP的促血管生成作用，进而抑制内皮细胞的增殖和迁移，同时TIMP-3还能通过抑制微血管内皮细胞对生长因子的反应而抑制肿瘤血管形成，并通过调节细胞增殖、促进细胞凋亡，进而抑制肿瘤的发展[11]。

　　通过对肺癌、前列腺癌、黑色素瘤等几组肿瘤细胞系的研究显示瘤细胞产生MMP-9的能力与其侵袭转移能力密切相关，通过选择性抑制MMP-9基因表达或增强TIMP-2、TIMP-3基因表达均可在一定程度上达到抑制肿瘤侵袭转移的目的[2]。吕国丽等[12]发现骨巨细胞瘤TIMP-3基因启动子的甲基化导致的TIMP-3表达水平下调促进了肿瘤的恶性进程。但也有研究表明TIMP-3在部分肿瘤中表达并非降低，而是升高[1]。而本项研究中TIMP-3的表达在骨巨细胞瘤复发组与非复发组之间无明显差异。由于TIMPs主要是作为MMPs的抑制因子而发挥作用的，因此研究MMPs/TIMPs的相对水平与肿瘤预后的关系可能更为重要。本实验结果也显示，虽然TIMP-3在复发组无明显升高，但是复发病例MMP-9高表达，两者表达的失衡，可能是肿瘤细胞局部浸润生长、肿瘤血管形成并导致复发的主要原因之一。

　　综上所述，骨巨细胞瘤是一种潜在恶性和高复发性的骨肿瘤，我们建议对该肿瘤进行金属蛋白酶MMP-9和MVD检测，其表达的增高可能对预示复发有一定作用。

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