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《肿瘤学》

环氧化酶2抑制剂Nimesulide对膀胱癌T24细胞体外生长的抑制作用

发表时间:2012-01-31  浏览次数:330次

  作者:王勤章,王蓉,丁国富,倪钊,张国  作者单位:新疆石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科,病统科

  【摘要】目的 观察环氧化酶2(COX2)抑制剂Nimesulide(NIM)对人膀胱癌T24细胞株体外生长的影响,并探讨其作用机制。方法 采用细胞形态学、MTT法、流式细胞术、吖啶橙溴化乙啶双染法(AOEB)等技术检测NIM对体外培养的人膀胱癌细胞株T24生长的抑制效应。结果 细胞形态学观察可见NIM对T24细胞生长具有明显的细胞毒作用;MTT法、流式细胞术分析显示NIM能明显抑制T24细胞的增殖,且呈剂量、时间依赖关系;细胞周期分析表明,NIM能使T24细胞G0/G1期细胞比例升高,S期和G2/M期细胞比例下降;流式细胞DNA直方图上出现典型的亚二倍体“凋亡峰”,细胞凋亡率与NIM作用时间和剂量相关;荧光显微镜检查显示NIM处理的T24细胞AOEB双染色后,细胞核内可见浓染致密的颗粒荧光,典型细胞可见新月形改变,固缩或片段化的核。结论 COX2抑制剂NIM对T24细胞生长具有明显的抑制作用,其作用机制可能与阻断细胞周期、诱导细胞凋亡等有关。

  【关键词】 环氧化酶2;尼美舒利;T24细胞株;体外作用

  The Inhibit Effect of the Cyclooxygenase2 Inhibitor Nimesulide on Human Bladder Cancer Cell Line T24 in Vitro

  WANG Qinzhang, WANG Rong, DING Guofu, NI Zhao, ZHANG Guoxi, LI Yinglong, WANG Xinmin, XIE Shunming

  Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Medical College, Shihezi University, Shihezi 832008,China;Department of Medical Archives

  Abstract:Objective To investigate the growth effects of the selective cyclooxygenase2 inhibitor Nimesulide on human bladder cancer cell line T24 in vitro, and to clarify its probable mechanism.Methods The T24 cell line was culture in vitro, and exposed to a range of concentrations of Nimesulide at different time. The effect of COX2 inhibitor Nimesulide on the proliferation and apoptosis of human bladder cancer cell line T24 in vitro were observed by using cell morphology , MTT assay , flow cytometry, fluorescent microscopy.Results Significant cytotoxicity of cyclooxygenase2 inhibitor Nimesulide on human bladder cancer cell line T24 were observed by cell morphology. MTT assay and flow cytometry show that cyclooxygenase2 inhibitor Nimesulide significantly inhibited cell proliferation of T24 cell line in vitro in a dose and timedependent manner .Cellcycle analysis by flow cytometry suggested that Nimesulide induced a decrease in S and G2/M phase population and a significant increase in G0/G1 population compared with untreated T24 cells. And a typical subdiploid peak before Phase G0/G1 was detected by flow cytometry. The rates of apoptosis were correlated with the concentration of Nimesulide and time of action. A typical apoptosis morphology were also observed by fluorescent microscopy.Conclusion The selective cyclooxygenase2 inhibitor Nimesulide has significant inhibit effects on the growth of T24 cell, which is closely related to block cell cycle and apoptosisinducing.

  Key words:Cyclooxygenase2; Nimesulide; T24 Cell lines; In vitro

  0 引言

  环氧化酶2(Cycloooxygenase2,COX2)在肿瘤发生、发展中扮演重要角色,而近来发现其特异性抑制剂尼美舒利(Nimesulide,NIM)有一定的抗肿瘤作用[1]。有关NIM对人膀胱癌细胞生长的影响鲜有报道。为此,我们以高表达COX2的膀胱癌细胞株T24为研究对象,观察NIM对T24细胞体外生长的影响,探讨COX2在膀胱肿瘤发病中的作用及其抑制剂的临床应用价值。

  1 材料与方法

  1.1 细胞系和主要试剂

  T24膀胱癌细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。RPMI1640培养基购自武汉亚法生物公司。小牛血清购自北京中山生物技术有限公司。NIM购自深圳晶美公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)染色液、二亚基亚砜(DMSO)等为Sigma公司产品。

  1.2 细胞培养及实验分组

  T24细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养基,在37℃、5%CO2培养箱中培养。取生长良好,接近融合的T24细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,调整细胞密度,接种到不同培养板中,根据预实验结果,将NIM稀释成0、600、1200、1800、2400、3000μmol/L 6种浓度,过滤除菌。当细胞生长到对数生长期时,分别加入不同浓度的NIM使终浓度为0、30、60、90、120、150μmol/L处理T24细胞48h,观察不同浓度NIM对T24细胞的影响。用终浓度为90μmol/L NIM处理T24细胞0~72h,观察不同作用时间对T24细胞的影响。

  1.3 细胞形态学观察

  实验分组同上,在倒置显微镜下观察T24细胞用药前后的形态变化。

  1.4 细胞生长抑制率测定

  使用四唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率,按以下公式计算细胞抑制率:

  细胞抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%

  1.5 流式细胞分析

  收集不同浓度NIM作用后T24细胞及90μmol/L浓度NIM处理后T24细胞,用流式细胞仪及细胞分析软件检测凋亡细胞数,同时分析细胞周期。

  1.6 荧光显微镜检测

  采用AOEB双染法染色,在荧光倒置显微镜下观察以下4种细胞:含正常核的活细胞(VN,绿色染色质,结构正常);含凋亡核的活细胞(VA,绿色染色质,高度聚集或断裂);含正常核的死细胞(NVN,橘红色染色质,结构正常);含凋亡核的死细胞(NVA,橘红色染色质,高度聚集或断裂)。

  1.7 统计学方法

  使用SPSS10.0统计分析软件包处理,比较采用方差分析、配对t检验,P<0.05为有统计学意义。

  2 结果

  2.1 NIM干预后T24细胞形态学观察

  24h药物30、60μmol/L组部分细胞形态失常,胞体变圆和不规则、脱壁,细胞间接触变松,胞浆中颗粒增多,增殖变慢,一些细胞死亡;90、120、150μmol/L组则有较多细胞出现上述改变,并可见部分癌细胞死亡从板上脱落。72h药物30、60μmol/L组多数细胞形态改变,较多细胞脱落,漂浮于培养基中;90、120、150μmol/L则可见大片死亡细胞及大量细胞碎屑,对照组细胞无形态学改变,呈上皮型贴壁生长,细胞轮廓清晰,细胞间接触紧密,细胞生长旺盛。

  2.2 NIM干预后对T24细胞增殖的影响

  MTT法检测结果显示T24细胞的生长受到明显的抑制,且此抑制作用与药物浓度和作用时间均呈明显的依赖关系。

  2.3 NIM对T24细胞凋亡和细胞周期影响的流式细胞仪分析

  流式细胞仪检测发现在DNA直方图上,对照组G0/G1峰前有离散的低DNA含量的弥散峰;而实验组G0/G1峰前有明显的凋亡峰,且随着NIM浓度增加,凋亡细胞数逐渐增多。用90μmol/L NIM处理T24细胞0~72h发现,随NIM处理时间的延长,凋亡细胞数也逐渐增多,见表3。同时发现,随NIM作用浓度的增加和作用时间的延长,G0/G1期细胞逐渐增多,且G0/G1期细胞的增多与NIM诱导T24细胞凋亡率呈正相关(r=0.68,P<0.05)。表明NIM对T24细胞凋亡的诱导及生长

   NIM对T24细胞增殖的抑制率

  注:同一浓度不同时间比较*P<0.05,不同浓度同一时间比较#P<0.05的抑制主要发生在细胞周期的G0/G1期。

  NIM对T24细胞凋亡和细胞周期的影响

  注:不同浓度实验组与对照组比较*P<0.05,**P<0.01

  不同作用时间NIM(90μmol/L)对T24细胞凋亡和细胞周期的影响

  注:不同作用时间实验组与对照组比较*P<0.05,**P<0.01

  A.未加药组;B.150μmol/L48h组

  N1M对T24细胞凋亡和细胞周期影响的流式细胞仪分析

  2.4 NIM对T24细胞凋亡的荧光染色观察

  结果显示,NIM处理的T24细胞染色后,凋亡细胞核内可见浓染致密的颗粒荧光,典型细胞可见新月形改变,固缩或片断化的核,而正常细胞核呈弥散均匀、较弱的荧光。

  3 讨论

  我们前期试验结果及一些研究报道也证实,膀胱肿瘤细胞可高表达COX2,而正常膀胱粘膜表达量很低[2]。因此,通过阻断COX2表达,抑制其活性,破坏其对肿瘤的生长调节,对膀胱肿瘤临床治疗的重要意义值得深入研究。

  我们以高表达COX2的膀胱癌T24细胞为研究对象,选择临床广泛使用的COX2特异性抑制剂NIM对其体外生长进行干预,通过采用不同方法,从多角度观察发现,NIM在体外可显著抑制T24细胞增殖,其抑制作用主要体现在阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡,并呈现剂量和时间依赖性,但其具体作用机制不详。Grosch 等[3]研究认为COX2抑制剂阻滞细胞周期可能涉及cyclinA、cyclinB1、p21WAF1、p27KIP1的参与。Hsu等[4]研究则表明,COX2可能对癌细胞具有凋亡保护作用,COX2抑制剂诱导的凋亡效应与COX2表达水平有相关性,而Akt活性的抑制可能在COX2抑制剂诱导的凋亡中起决定性作用,但有待进一步的研究。

  我们的研究结果初步表明,COX2特异性抑制剂NIM在体外可通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡对T24细胞生长产生明显的抑制作用,提示COX2可能是一种促进细胞增殖并抑制细胞凋亡的新基因,在基因水平或蛋白水平下调COX2表达或抑制活性,可有效地抑制膀胱癌细胞的增殖,并从根本上失去对凋亡的抗拒力,而变得易于发生凋亡,COX2可作为新的靶分子有助于基因治疗或设计新的药物治疗膀胱癌。而作为COX2特异性抑制剂,由于NIM能高度选择性抑制与PGs合成有关的COX2的活性,而不影响胃、肾等器官的生理性PGs合成有关的COX1的活性,从根本上解决了以往解热镇痛类药物对胃肠道的刺激与对肾功能的损害[5],因此更具可用性,NIM作为膀胱癌的凋亡诱导剂亦有着良好的临床应用前景。

  【参考文献】

  [1] Guo GL, Zhang XH, Yao ZX.The effect of selective cyclooxygenase2 inhibitor nimesulide on breast cancer induced by dimethylbenzoic acid in rats[J].Zhonghua Wai Ke Za Zhi, 2005,43(15):10171020.

  [2] 王勤章,王蓉,丁国富,等.膀胱移行细胞癌中环氧化酶2和Ki67表达的相互关系及其临床意义[J].肿瘤防治研究,2004,31(11):685687.

  [3] Grosch S,Tegeder I,Niederberger E,et al.COX2 independent induction of cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer cells by the seletive COX2 inhibitor celecoxib[J]. FASEB, 2001,15(14):27422744.

  [4] Hsu AL,Ching TT,Wang DS,et al.The cyclooxygenase2 inhibitor celecoxib induces apoptosis by blocking Akt activation in human prostate cancer cells independently of bcl2[J].J Biol Chem,2000,275(15):1137911403.

  [5] Shaik MS, Chatterjee A, Singh M. Effect of a selective cyclooxygenase2 inhibitor, nimesulide, on the growth of lung tumors and their expression of cyclooxygenase2 and peroxisome proliferator activated receptorgamma[J].Clin Cancer Res, 2004,10(4):15211529.

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